Matične ćelije izolovane iz krvi pupčanika

Hematopoetski sistem predstavlja skup tkiva i organa koji učestvuju u stvaranju ćelija krvi tokom embrionalnog, fetusnog i postnatalnog perioda života. Hematopoeza (od antičkog grčkog: αἷμα-“krv”, ποιεῖν-“napraviti”) je proces stvaranja uobličenih elemenata krvi u organima hematopoetskog sistema. 

Hematopoeza (Dijagram 1) uključuje:

• samoobnavljanje,
• proliferaciju,
• diferencijaciju i
• usmereno sazrevanje matičnih ćelija hematopoeze (engl. Hematopoietic Stem Cells, HSCs).

Hematopoeza se može podeliti na prenatalnu i postnatalnu hematopoezu. Prenatalna hematopoeza počinje u 3. nedelji razvića i odvija se van embriona, intravaskularno u krvotoku žumančane kese, gde se održava do 6. nedelje razvića. Ovaj period se označava kao mezoblastni period hematopoeze i u njemu se produkuju samo eritrociti koji imaju kratak životni vek. U periodu od 6. do 24. nedelje razvića, hematopoeza se odvija u jetri i slezini – hepatolijenalni period. Početkom 6. nedelje, matične ćelije hematopoeze migriraju iz žumančane kese u jetru, ili u nju dospevaju cirkulacijom, gde proliferišu i diferenciraju se u ćelije svih krvnih loza. Hematopoeza se u jetri od 6. meseca do rođenja postepeno smanjuje. Tokom 10. nedelje razvića hematopoetske ćelije iz jetre naseljavaju timus u kome počinje diferencijacija limfocita. Od 4. meseca prenatalnog razvića glavni hematopoezni organ predstavlja koštana srž – mijeloidni period.

Postanatalna hematopoeza se odvija u koštanoj srži svih kostiju, a posle 18. godine samo u koštanoj srži (aktivna, crvena koštana srž) kostiju lobanje, grudne kosti, rebara, kičmenih pršljenova, kostiju karlice i proksimalnih epifiza humerusa i femura. Eritrociti, granulociti, monociti i trombociti nastaju u crvenoj koštanoj srži, dok limfociti nastaju delom u limfnom tkivu, a delom u koštanoj srži. Jetra i slezina ne učestvuju u hematopoezi osim kod teških bolesti koje zahvataju koštanu srž.

Po danas prihvaćenoj monofiletskoj teoriji hematopoeze, od jedne multipotentne hematopoetske ćelije mogu da nastanu svi oblici krvnih ćelija i uobličeni elementi krvi (Šema 1).

Važna osobina ove ćelije jeste da ima sposobnost samoobnavljanja i diferenciranja u dve vrste multipotentnih ćelija – za mijeloidnu i limfoidnu lozu. Samoobnova označava mogućnost održavanja sopstvene populacije tokom čitavog života jedinke zahvaljujući asimetričnim deobama majke ćelije. Deobom multipotentnih ćelija mogu ponovo nastati multipotentne ćelije, ili nastaje više tipova diferenciranijih unipotentih (progenitorskih) ćelija, čijom daljom deobom i diferencijacijom nastaju isključivo ćelije jedne krvne loze koje su morfološki prepoznatljive.

Mogućnost nalaženja matičnih ćelija hematopoeze u koštanoj srži je 1 na 10 000, odnosno one čine oko 0.01% ćelija koštane srži. 5% ćelija koštane srži čini nešto veća populacija progenitorskih ćelija. Ostalih 95% ćelija u koštanoj srži čine ćelije koje se nazivaju prekursori (prethodnici) zrelih ćelija krvi. Ćelije prekursori mogu da se podele nekoliko puta pre nego što postanu zrele ćelije krvi i izađu u cirkulaciju.

Matične ćelije hematopoeze i progenitorske ćelije su morfološki veoma slične malom limfocitu, pa ih je teško razlikovati pod svetlosnim mikroskopom. Imaju relativno veliko jedro i malu količinu citoplazme što ukazuje na to da im je osnovna uloga da se dele i diferenciraju u pravcu onih krvnih loza koje su organizmu potrebne u određenoj fiziološkoj ili patološkoj situaciji. Razlika između matičnih ćelija i progenitora je u tome što su matične ćelije uglavnom u G0 fazi, iz koje izlazi onda kada postoji potreba za većim brojem progenitora. Mali broj multipotentnih matičnih ćelija hematopoeze u stvari služi organizmu kao strateški nepresušni izvor (zbog samoobnove matičnih ćelija) različitih progenitorskih ćelija čiji je zadatak kontinuirano stvaranje prekusorske ćelije.

Hematopoeza je u odnosu na naziv zrele ćelije podeljena na: eritropoezu (stvaranje eritrocita ili crvenih krvnih ćelija), mijelopoezu (stvaranje leukocita ili belih krvnih ćelija), monopoezu (stvaranje monocita), limfopoezu (stvaranje limfocita) i trombopoezu (stvaranje trombocita ili krvnih pločica). Mijelopoeza obuhvata granulopoezu (stvaranje neutrofila, eozinofila i bazofila) i agranulopoezu.

Matične ćelije hematopoeze se mogu izolovati iz koštane srži, periferne krvi i pupčane vrpce.

Karakteristike matičnih ćelija hematopoeze izolovanih iz pupčane vrpce

Eliane Glukman je 1988. godine prva primenila da HSCs izolovane iz pupčane vrpce u bolnici „Sent“ u Parizu, produžavajući život petogodišnjem dečaku koji je patio od Fanconi anemije. Krv iz pupčane vrpce se prikuplja na taj način što se nakon odvajanja novorođenčeta od majke presecanjem pupčane vrpce, širokom iglom ubode u venu u pupčanoj vrpci, te se putem gravitacije pusti da se krv sliva u vrećicu sa antikoagulantnim sredstvom na bazi citrata koja se nalazi na kraju. Sepaks uređaj omogućava zatvoren sistem za automatsku obradu krvi pupčanika u roku od 20 min. Prosečna količina krvi u pupčanoj vrpci je oko 50-11 ml. Količina krvi ispod 70ml nije poželjna. Na 100 nukleisanih ćelija ima oko 0,1-0,8 CD34+ HSCs. Broj matičnih ćelija je u korelaciji sa pohranjenim volumenom (Slika 1).

Po podacima Bone Marow Donor Worldwide (http://www.bundw.org., March 2010.) u javnim nacionalnim bankama, danas je u svetu pohranjeno više od 419.000 uzoraka krvi iz pupčane vrpce, a procenjuje se da je u privatnim porodičnim biobankama pohranjeno 1.000.000 uzoraka. Krv iz pupčane vrpce pohranjuje se od 1991. godine (Grafik 1).

Ti uzorci podvrgavaju se HLA-tipizaciji i pripremaju za alogenu transplantaciju. HLA-sistem (engl. Humal Leukocite Antigens, antigeni tkivne podudarnosti) zadužen je za prepoznavanje sopstvenih ćelija od ćelija drugog porekla (ćelije raka, bakterije, virusi, itd.). Ovi antigeni nalaze se na površini leukocita i drugih ćelija u organizmu. Dele se na šest grupa, koje su označene slovima abecede (A,B,C,D,R,E). U slučaju transplantacije donirane koštane srži potrebna je podudarnost svih 6 grupa i genska podudarnost, dok je u slučaju transplantacije krvi iz pupčane vrpce, potrebna podudarnost samo 3 od 6 grupa, zbog nezrelosti matičnih ćelija iz krvi pupčane vrpce, koje stoga izazivaju daleko manju reakciju kalem protiv domaćina (tj. transplantat protiv primaoca).

Matične ćelije poreklom iz pupčane vrpce su mlade, primitivne, nespecijalizovane matične ćelije, sa visokim proliferativnim kapacitetom, koje su stare samo devet meseci i koje su se razvijale bez značajnih spoljašnjih uticaja (Slika 1). Nazivaju se i „neodređene“ matične ćelije, jer nemaju ograničen spektar specijalizovanih ćelija koje mogu od njih da nastanu (može da nastane oko 220 tipova ćelija), za razliku od adultnih matičnih ćelija koštane srži i periferne krvi koje su već usmerene prema određenom tkivu.

U slučaju transplantacije matičnih ćelija koštane srži ili periferne krvi potrebna je stopostotna podudarnost primaoca i davatoca kako bi se izbegle po život opasne komplikacije, kao što je reakcija kalema protiv domaćina (engl. Graft versus Host Disease, GVHD). Matične ćelije pupčane vrpce su manje zrele, te imaju manji imunogeni potencijal. Stoga u transplantaciji krvi iz pupčane vrpce nije potrebna stopostotna podudarnost da bi se ostvario uspeh jednak, ili u nekim slučajevima bolji nego klasična transplantacija matičnih ćelija, odnosno, reakcija kalema protiv domaćina je manje učestala i manje izražena. Prema nekim istraživanjima, učestalost te reakcije kod bolesnika lečenih krvlju iz pupčane vrpce je oko 6%, dok učestalost kod bolesnika lečenih krvlju iz koštane srži ili perifernom krvlju iznosi od 15-25%.

Fenotip HSCs kod ljudi nije tako detaljno izučen kao fenotip HSCs miša. Sam fenotip ne ukazuje na funkcionalnu aktivnost pojedinih populacija HSCs. Trenutno, HSCs pupčane vrpce su fenotipski identifikovane kao CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, dok su adultne multipotentne progenitorske ćelije identifikovane kao CD34+, CD38-, CD90-, CD45RA-4.

Postoji određen broj intraćelijskih molekula koji su povezani sa funkcionalnim aktivnostima HSCs, uključujući opstanak ćelija, samoobnavljanje, proliferaciju, diferencijaciju i migraciju (homing, mobilizacija i hemotaksa). Ovi intraćelijski molekuli uključuju p21cip1/wafl, p27kip1, Stat3, stat5, Notch, Wnt, β-katenin, GSK-3, BMP4, Hoxb4, FoxO, GATA-1, HIF-1α, Rheb25. Još uvek se ne zna kako da se najbolje i najefikasnije rukuje ovim intraćelijskim molekulima i njihovim mrežama za poboljšanje ekspanzije, homing i transplantacije, ali znanja o njima mogu poboljšati kapacitet ograničavajućeg broja HSCs pupčane vrpce da se proširi in vitro ili in vivo, i učiniti homing efikasnijim.

Mikrookruženje u kom HSCs opstaju, samoobnovljaju se, proliferišu i diferenciraju se građen je od interaktivne mreže stromalnih ćelija, mezenhimalnih matičnih/stromalnih ćelija, endotelnih ćelija i endotelnih progenitorskih ćelija, fibroblasta i određenih tipova krvnih ćelija.

Transplantacijom matičnih ćelija poreklom iz pupčane vrpce može da se leči veliki broj bolesti, kao što su akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, mijelodisplastični sindrom, neuroblastom, adrenoleukodistrofija, amegakariocitna trombocitopenija, Blackfan-Diamond sindrom, Fankoni anemija, Hunter-ov sindrom, teška aplastična anemija, Kostman-ov sindrom, osteopetroza, talasemija i dr.

Prednosti i nedostaci pupčane vrpce kao izvora mezenhimalnih matičnih ćelija

Prednost pupčane vrpce kao izvora hematopoetskih matičnih ćelija za transplantaciju je u tome što je krv odmah na raspolaganju, pristup je lak i brz, za razliku od izdvajanja matičnih ćelija iz periferne krvi koji je veoma složen i skup proces koji se poslednjih desetak godina sprovodi rutinski. U mnogim bolestima koje se danas leče transplantacijom matičnih ćelija vreme je važan činilac u uspehu lečenja. Ukoliko se s lečenjem počne ranije, uspeh transplantacije je veći. Druga prednost pupčane vrpce kao izvora hematopoetskih matičnih ćelija je što je uzimanje krvi iz pupčane vrpce potpuno bezbolan i bezbedan proces i za majku i za dete, za razliku od procesa izdvajanja matičnih ćelija iz koštane srži koji je veoma bolan. Treća prednost je ređa pojava reakcije kalema protiv domaćina, što je objašnjeno u prethodnom delu seminarskog rada. Četvrta prednost je očuvana sposobnost mezenhimalnih matičnih ćelija (engl. Mesenchymal Stem Cells, MSCs) iz pupčane vrpce u reakciji kalema protiv domaćina kod leukemije, što je osnova alogene transplantacije MSCs kod mnogih malignih bolesti krvi.

Pored važnih prednosti, postoje i određeni nedostaci. Jedan od njih se odnosi na ograničen i mali broj sakupljenih matičnih ćelija u jedinici krvi pupčane vrpce. Krv pupčane vrpce ima veću koncentraciju hematopoetskih matičnih ćelija nego što se obično nalazi u krvi odraslih. Međutim, mala količina krvi dobijena iz pupčane vrpce (obično oko 50ml), pa samim tim i manji broj MSCs (nekoliko miliona), je premali za korišćenje u transplantaciji kod odraslih, ali je često dovoljan za transplantaciju kod dece. Zbog manjeg broja matičnih ćelija u jedinici krvi pupčanika, presađene matične ćelije iz krvi pupčanika se prihvataju (usađuju) sporije, nego matične ćelije iz koštane srži ili periferne krvi. Pre nego što se kalemljenje desi, pacijenti su izloženi riziku nastanka infekcija opasnih po život.

Istraživanja unapređenja efikasnosti transplantacije MSCs iz krvi pupčane vrpce idu u pravcu unapređenja tehnike prikupljanja matičnih ćelija iz krvi pupčanika i ispitivanja upotrebe više od jedne jedinice krvi pupčanika u jednom presađivanju kako bi se kompenzovao ograničen broj izdvojenih MSCs, i videlo da li doprinosi smanjenju vremena potrebnog za prihvatanje/kalemljenje. Upotreba više od jedne jedinice krvi pupčanika je rezultirala mnogo većim brojem transplantacija za lečenje odraslih, i ovo predstavlja važan napredak na polju transplantacije MSCs poreklom iz pupčane vrpce.

Ipak, od dve ili više transplantirane jedinice krvi u jednom primaocu obično se dešava da se ćelije samo jednog davaoca mogu detektovati posle nekoliko meseci. Još uvek nije jasno zašto samo jedna jedinica obično „pobeđuje”, iako je predloženo da jedinice sa niskom vitalnošću CD34+ ćelija unutar ukupne populacije relativno nepodeljenih ćelija imaju nisku verovatnoću kalemljenja posle duple transplantacije jedinica krvi pupčanika. Nedostatak upotrebe višestrukih krvi pupčanika za transplantaciju je to što je ovo povezano sa povećanjem rizika od GVHD, dok je transplantacija samo jedne jedinice povezana sa smanjenjem rizika od GVHD.

Takođe, upotreba višestrukih jedinica krvi pupčanika nije značajno ubrzala vreme kalemljenja ćelija. Sindrom prekalemljenja, nepovezan sa GVHD, je primećen posle transplantacije duplih jedinica krvi, ali ovo stanje odgovara kratkoročnoj upotrebi kortikosteroida. Upotreba višestrukih jedinica zahteva bitno povećanje troškova u poređenju sa upotrebom jedne jedinice krvi. U međuvremenu, bitno je bolje razumeti biologiju i funkcionalne mogućnosti humanih MSCs, da bi se mogle modulirati ove ćelije, posebno one u pupčanoj krvi, radi povećanja kliničke efikasnosti.

Postoji veliki broj drugih načina da se poboljša kalemljenje MSCs iz pupčane vrpce. Oni uključuju npr. povećanje ubiranja matičnih ćelija na porođaju. Takođe je sada i sama placenta identifikovana kao moguć izvor MSCs i može se, sa skupljanjem ćelija iz pupčanika perfuzijom, takođe prikupiti ćelije direktno iz placente. Mogućnosti skupljanja predstavljaju logistički problem koji nije beznačajan, i mora se biti siguran da se ne sakupe ćelije poreklom od majke zajedno sa pupčanim i placentarnim ćelijama, pošto ovo može dovesti do povećanog i potencijalno opasnog po život GVHD. Verovatno je da se takvi manevri moraju obavljati u odabranim centrima opremljenim za takvo skupljanje. Dodatna sredstva za poboljšanje kalemljenja zahtevaju direktnu administraciju ćelija u koštanu srž (intraosalno), zaobilazeći problem homing-a, ili dodavanjem drugih vrsta ćelija sa matičnim ćelijama pupčane vrpce, kao što su mezenhimalne matične ćelije kao ko-infuzija. Takvi napori takođe nisu bez potencijalno komplikovanih efekata.

Krioprezervacija matičnih ćelija iz krvi pupčanika

Skoro sve transplantacije matičnih ćelija iz krvi pupčanika sprovođene su tako što su izolovane matične ćelije prvo bile zamrnute i čuvane u javnim ili privatnim „bankama“ matičnih ćelija. Uspeh transplantacije oslanjao se na to da će matične ćelije nakon odmrzavanja biti vijabilne i dovoljno dobre u kvantitativnom i kvalitativnom smislu. Matične ćelije iz krvi pupčanika koje su najduže bile skladištene, tj. zamrznute, a kasnije korištene za uspešnu kliničku transplantaciju su čuvane oko 12 godina. Najduže preživeli pacijent kome je urađena transplantacija matičnih ćelija iz krvi pupčanika živeo je 20 godina posle transplantacije. Ta transplantacija izvršena je u oktobru 1988. godine.

Urađena je velika studija koja je imala za cilj ispitivanje preživljavanja skladištenih matičnih ćelija iz krvi pupčanika nakon 15 godina čuvanja. Istraživanje se zasnivalo na analizi istih uzoraka pre i posle zamrzavanja. Rezultati govore o sposobnosti odmrznutih ćelija za više od 250 ex vivo ekspanzija i mogućnost uspešne transplantacije takvih ćelija.

Svakako da ostaje da se metode krioprezervacije još više usavrše.

Izvor:

1. Sadler TW. Langman’s Medical Embriology. Lippincott Will Wil, Philadelphia, 2006.
2. Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, Friedman HS, Douglas GW, Devergie A, Esperou H, Thierry D, Socie G, Lehn P, Cooper S, English D, Kurtzberg J, Bard J, Boyse E. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 1989; 321(17):1174-8.
3. Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE, Blazar BR, McGlave PB, Miller JS, Verfaillie CM, Wagner JE. Transplantation of 2 partially HLA-matched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood 2005; 105, 1343–1347
4. Majeti R, Park CY, Weissman IL. Identification of a hierarchy ofmultipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell 2007; 1, 635–645.
5. Shaheen M, Broxmeyer HE. The humoral regulation of hematopoiesis. In Hematology: Basic Principles and Practice, 5th Edition. R. Hoffman E.J. Benz, Jr, S.J. Shattil, B. Furie, L.E. Silberstein, P. McGlave, H. Heslop, and J. Anastasi, eds. Elsevier Churchill Livingston, Philadelphia, PA. 2009; Part III, Chapter 24, pp. 253–275.
6. Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE, Blazar BR, McGlave PB, Miller JS, Verfaillie CM, Wagner JE. Transplantation of 2 partially HLA-matched umbilical cord blood units to enhance engraftment in adults with hematologic malignancy. Blood. 2005; 105(3):1343-7.
7. Brunstein CG, Barker JN, Weisdorf DJ, DeFor TE, Miller JS, Blazar BR, McGlave PB, Wagner JE. Umbilical cord blood transplantation after nonmyeloablative conditioning: impact on transplantation outcomes in 110 adults with hematologic disease. Blood. 2007; 110(8):3064-70.
8. Scaradavou A, Smith KM, Hawke R, Schaible A, Abboud M, Kernan NA, Young JW, Barker JN. Cord blood units with low CD34+ cell viability have a low probability of engraftment after double unit transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2010; (4):500-8.
9. Patel KJ, Rice RD, Hawke R, Abboud M, Heller G, Scaradavou A, Young JW, Barker JN. Pre-engraftment syndrome after double-unit cord blood transplantation: a distinct syndrome not associated with acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant. 2010; (3):435-40.