Zadnjih par decenija donele su značajna nova saznanja i bolje razumevanje biologije raka pankreasa. Analize na molekularno-genetskom nivou pružile su dokaze o postojanju nekoliko gena koji su sigurno involvirani na različitim stadijumima u proces karcinogeneze. Najbolji primeri su: KRAS, TP53, INK4A kao i aberantna ekspresija ili genska mutacija komponente za EGF (epidermal growth factor) i TGF-beta (transforming growth factor-beta) signalne puteve (kaskade).
Histološka evaluacija, pak, adenokarcinoma uklonjenih hirurškom resekcijom omogućila je novu morfološku klasifikaciju displastičnih lezija koje predstavljaju prekursore raka pankreasa tzv. pankreasne intraepitelne neoplazije (PanIN) što je dalje vodilo tačnijem određivanju vremena u kojem određene mutacije deluju u procesu razvoja raka pankreasa. Konačno i, genetskim inženjeringom, kreirani modeli raka pankreasa kod eksperimentalnih životinja, omogućili su pronalaženje veze između specifičnih genskih mutacija u target ćelijama I razvoja prekanceroznih lezija I invazivnih karcinoma.
Poznato je da je karcinogeneza dugotrajni, višestepeni proces koji uključuje akumulaciju genskih i epigenskih mutacija. Alteracije (odstupanja) u oncogenic pathways (putevima onkogena) ključne su za proces karcinogeneze. Tri najznacajnija takva odstupanja u putevima onkogena odnose se na: ras, receptor tirozin-kinaza i Akt/PI3K.
Ras signalni put. Najvažniji onkogen za pankreasni karcinom svakako je KRAS. Mutacije ovog onkogena registrovane su u 75-90% slučajeva. Drugi članovi RAS familije (HRAS I NRAS) očito nisu u vezi sa pankreasnim kancerom. Ras je zapravo, mali GTP-vezujući protein koji igra ulogu u growth-faktor posredovanim, putevima transmisije signala. Mutacije KRAS-a su generalno ograničene na kodon 12(p) ali mogu često biti afektirani i kodoni 13 i 61. Rezultat ovih mutacija zapravo je konstitutivno (hiper)aktivna forma Ras-a zbog čega je protein “zarobljen” u GTP-vezujućem stanju. Ovako aktivni Ras sada može stimulisati čitav niz kaskada signala. Ipak treba reći da se još uvek potpuno ne zna koji je to specifični pathway i kakva je njegova uloga u karcinogenezi karcinoma pankreasa. Postoji više dokaza u prilog tvrdnji da se KRAS mutacija odigrava negde u ranoj fazi karcinogeneze. Verovatno je da je neophodna “saradnja” još nekih genskih mutacija. Ove mutacije se, interesantno, često mogu naći i kod benignih lezija pankreasa. 2003.godine prikazane su genetski izazvane PanIN lezije na pankreasu miševa, kao posledice aktivacije oncogenic KRAS-a (KRASG12D). U roku od 20 meseci, više od 90% životinja imalo je invazivni karcinom pankreasa. I dok sada sa sigurnošću možemo reći da ekspresija mutiranog K-ras, K-rasG12D, vodi nepogrešivo razvoju karcinoma pankreasa, treba dodati da se ovaj proces, mutacijom tumor-supresor gena (INK4A/ARF I TP53) može znatno ubrzati.
Receptor tirozin-kinaza signalni put. Neadekvatne ekspresije različitih receptora za growth-faktore takođe mogu imati ulogu u nastanka raka pankreasa. Epidermalni faktor rasta (EGF) i članovi EGF porodice, kao na primer TGF-alfa, su, pokazano je, over-eksprimirani. EGF receptor, poznat još i kao humani EGF receptor 1 (HER1) prisutan je na površini različitih tipova ćelija I pokazuje ligand-zavisnu, tirozin-kinaza aktivnost. On pokazuje sličnost u sekvencama sa nekoliko drugih receptora, uključujući tu i HER2, HER3 i HER4. Ovi se receptori sastoje od ekstracelularnog, ligand-vezujućeg, domena bogatog u cisteinu, transmembranskog domena i intracelularnog domena koji pokazuje tirozin-kinaza aktivnost. Inicijalni događaj predstavlja vezivanje liganda za ekstracelularni domen što dovodi do homo i/ili heterodimerizacije EGF receptora a to opet ima za rezultat fosforilaciju tirozinskog ostatka na intracelularnom domenu. Fosforilizovani ostaci sad mogu “udomiti” intracelularne medijatore, pojačavajući na taj način prenos growth signala. Over-ekspresija EGF receptora, HER2 I HER3 dokazana je kod karcinoma pankreasa. Štaviše, ekspresija HER2 primećena je i kod precursor-lezija, pokazujući “umešanost” iste već na niovu ranog stadijuma karcinogeneze. Uloga i značaj receptora sa tirozin kinaza-aktivnošću u karcinognezi je i nedavno potvrđena u Fazi III trajala uznapredovalog pankreasnog karcinoma gde je korišćen erlotinib, reverzibilni inhibitor tirozin kinaze EGF receptora. Klinička praksa takođe je potvrdila da dodatak erlotiniba gemcitabinu, poboljšava preživljavanje kod uznapredovalog karcinoma pankreasa. Over-eksprimirani (prekobrojni) tirozin-kinaza receptori u karcinoma pankreasa zapravo su, insulin-like growth factor a njegov tirozin-kinaza receptor je insulin growth faktor receptor 1. Članovi porodice fibroblast growth faktora koji slično aktiviraju tirozin-kinaza receptore, takođe su over-eksprimirani kod karcinoma pankreasa.
PI3K/Akt signalni put. Fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K ) i njegov target (cilj) Akt važni su downstream efektori (prenosnici, mesindžeri) tirozin-kinaza receptora. PI3K/Akt signali imaju važnu ulogu u proliferaciji, preživljavanju i rezistenciji na apoptozu tako sto Akt posreduje u inhibiciji pro-apoptotičnih protein kao sto su BAD i caspase 9. Štaviše, on aktivira transcription factor nuclear factor (NF)-kB koji promoviše survival i rezistencu na hemoterapiju. Rezistenca na apoptozu važan je faktor u biologiji raka pankreasa (24,25,reviews)!! Mammalian target of rapamycin (mTOR) još jedan je važan prenosnik (effector) u PI3K/Akt signalnom putu i ima centralnu ulogu u ćelijskom preživljavanju i proliferaciji tako što vrši modulaciju ćelijskog odgovora na mitotičke (mitogene) stimuluse i različite nutritijente, naročito amino kiseline. Disregulacija PI3K/Akt pathway-a moguća je na više nivoa. Pokazano je da je Akt2 gen aktiviran ili amplificiran i u do 60% slučajeva karcinoma pankreasa. Štaviše, mTOR-S6K1 signalni put, čini se da je, konstitutivno aktiviran i esencijalan u proliferaciji ćelija raka pankreasa in vitro. Treba dodati još da je tumor-supresor gen PTEN, čiji proteinski produkti mogu inhibirati m-TOR i antagonista je PI3K signalnog puta, često funkcionalno inaktivan kod karcinomapankreasa. Tako su zapažane sledeće promene: metilacija PTEN gen promotera, gubitak proteinske ekspresije, redukcija nivoa mRNA ili gubitak heterozigotnosti linked markera. Stanger i sar. nedavno su uspeli generisati miševe kod kojih je PTEN gen specifično neutralizovan (uklonjen) iz pankreasnih ćelija. Uočili su, prateći ovu grupu životinja, razvoj i pojavu značajnih abnormalnosti pankreasa što je rezultiralo masovnim oboljevanjem miševa već za 2-3 meseca i čestim letalnim ishodom u 6.mesecu starosne dobi. Kasnijom analizom, uočene su morfološke promene tkiva pankreasa u smislu zamene gotovo celog egzokrinog tkiva duktalnim strukturama. U 2 od 14 životinja, uočena je maligna transformacija.Tako se može reći da je precizna i skladna regulisanost PI3K pathway-a, važno kao za normalan razvoj pankreasa tako iza prevenciju razvoja karcinoma.
TUMOR-SUPRESOR GENSKI PUTEVI
Karcinom pankreasa je u visokom procentu povezan sa inaktivacijom 3 tumor-supresorska gena: p16INK4A, TP53 i SMAD4/DPC4. Postojanje jedno funkcionalne kopije u većini je slučajeva dovoljno za održanje funkcije tumor-supresor gena što čini inaktivaciju obe kopije neophodnom za inicijaciju karcinogeneze. Inaktivacija tumor-supresor gena odigrava se najčešće kroz intragensku mutaciju jednog alela udruženu sa gubitkom drugog alela mada se i homozigotne delecije takođe mogu javiti. Inaktivacija se takođe može dogoditi putem epigenetic means, obično promoter-posredovanim “utišavanjem” (silencing) gena kroz DNA metilaciju, karakterisitičnu za CpG islands(ostrvca). Već je objašnjena uloga PTEN gena u kontekstu PI3K signalog puta. Sad ćemo opisati i druge tumor-supresor genske puteve koji igraju važnu ulogu u biologiji raka pankreasa.
P16INK4A/retinoblastoma protein pathway. Ključni regulatori progresije ćelijskog ciklusa uključuju ciklin i ciklin-zavisne kinaze (CDKs). CDKs postaju aktivne (kinaza activity) kroz interakciju sa odgovarajućim ciklinima. Na primer, u ćelija kod kojih se indukuje rast, važan rani događaj je interakcija ciklina D sa ciklin-zavisnom kinazom 4 (CDK4/CDK6). Ciklin D-CDK4/CDK6 kompleks zatim vrši fosforilaciju retinoblastoma protein (Rb) sprečavajući formiranje E2F-Rb kompleksa. Ovo će rezultirati transkripcijom brojnih E2F-regulisanih gena potrebnih za prelazak iz G1 u S-fazu ćelijskog ciklusa. Produkt INK4A gena interferira sa ovim procesom vezujući se za CDK4/CDK6 i na taj način sprečava formiranje aktivnog ciklin D-CDK/CDK6 kompleksa. Inaktivacija pRb/p16 tumor-supresorskog pathway-a može se dogoditi kroz alteraciju pRb, CDK4, ciklin-a D ili p16INK4A, od čega je često dovoljan samo jedan “događaj” za abrogation ovog puta mada je kod karcinoma pankreasa, funkcionalna inaktivacija INK4A daleko najčesća. Abrogation p16ink4a funkcije, kroz mutaciju, deleciju ili promoter hipermetilaciju INK4A gena, prisutna je u oko 80-95% sporadičnih karcinoma pankreasa. p16 genski lokus kodira još jedan tumor supresor, p19ARF koji stabilizuje p53 inhibirajući njegovu MDM-2-zavisnu proreolizu. Iako mnogi slučajevi karcinoma pankreasa pokazuju gubitak i INK4A i ARF prepisa (transcripts), evidentirani su slučajevi sporadičnih mutacija na p16 gde je ARF pošteđen. Stoga se da zaključiti da je i samo gubitak INK4A dovoljno snažan podsticaj za razvoj karcinoma pankreasa. I dok se K-ras mutacije pojavljuju već u ranim prekursor lezijama, gubitak p16INK4A uočen je u umereno uznapredovalim promenama (PanIN2 i PanIN3). Aguirre i sar. nedavno su opisali efekte kombinovanja pankreas-specifične ekspresije K-ras, K-rasG12D i neutralizovanja INK4A/ARF alela. Još u toku trajanja eksperimenta, K-rasG12D sam doveo je do nastanka PanIN-ova. Sam INK4A/ARF alelski deficit, nije uspeo da izazove neoplastičke lezije pankreasa. Zajedno, pak ova kombinacija rezultirala je ranim razvojem PanIN lezija i rapidnom progresijom u invazivni i potom metastatski tumor. Autori su iz ovoga zaključili da K-ras inicira nastanak PanIN lezija a INK4A/ARF tumor-supresori sprečavaju konverziju ovih promena u duktalni karcinom.
p53. TP53 je najčešće inaktivirani tumor-supresor gen u tumorima uopšte pa i kod karcinoma pankreasa gde više od 50% slučajeva ima mutaciju ovog gena. p53 zapravo je transcription factor koji je aktivan u ćelijskom odgovoru na različite vrste stresa kao iradijacija, hipoksija, lekovima-uzrokovana genska oštećenja i aktivacija onkogena. Aktiviran on modulira transcription response dovodeći do aresta ćelijskog ciklusa ili apoptoze. Ove mutacije su relativno kasni događaj u karcinogenezi, odigravajući se u kasnijem stadijumu PanIN-ova (PanIN2 iPanIN3). Gubitak p53 tako verovatno dovodi do izrazite genske nestabilnosti koja je tipična za karcinom. Ovakav stav podržan je i nedavnim eksperimentima koji su sproveli Hingorani i sar. koji su kombinovali istovremeno ekspresiju mutanta p53 i aktivirani K-rasG12D na miševima. Kao i kod INK4A/ARF alelskog deficit, p53 u kombinaciji sa K-rasG12D doveo je do metastatskog karcinoma pankreasa. I primarni i sekundarni tumori kod eksperimentalnih životinja, pokazivali su visok stepen genomske nestabilnosti.
TGF-beta/Smad4 pathway. TGF-beta je prototip čitave porodice polipeptidnih faktota rasta koji utiču na niz bioloških procesa kod normalnih i transformisanih ćelija kao sto su ćelijski rast, diferencijacija, angiogeneza i ćelijska invazija. Različite vrste TGF-beta kod sisara (TGF-beta1, TGF-beta2 I TGF-beta3) iniciraju čitav niz intraćelijskih događaja, interakcijom sa specifičnim receptorima, TGF-beta tipI i tipII. Downstream signali se dalje prenose putem Smad familije protein koji formiraju heterooligomerne Smad tnascription faktor komplekse. Sada je jasno da growth-supresor efekti TGF-beta čine jednu tumor-supresorsku osovinu koja uključuje ligand, receptore, prenosioce signala i njihove mete (transcriptional targets). Prekomerna ekspresija sva 3 oblika TGF-beta dokazana je u karcinoma pankreasa dok su neke studije prijavile i over-ekspresiju TGF-beta receptora. Čini se da u nekoj instanci ćelije raka gube sposobnost odgovora na growth-supresivne efekte TGF-beta. U prilog tome je i opažanje da su mutacije Smad4 gena, koji kodira važan medijator u TGF-beta signalnom putu, takođe česte kod raka pankreasa. Štaviše one su kod raka pankreasa češće nego kod bilo kog drugog karcinoma. Precizno govoreći, SMAD4/DPC4 lokus na 18-tom hromozomu koji kodira Smad4, pokazuje gubitak heterozigotnosti u oko 90% karcinoma pankreasa. U više od polovine slučajeva, SMAD4/DPC4 je bialelski inaktiviran kao posledica homozigotne delecije ili missense/nonsense mutacije drugog alela. Treba reći da je ćelijski odgovor na TGF-beta delimično ali ne u potpunosti zavistan od Smad4. Skorašnja studija je pokazala da neutralizovanje Smad4, čini ćelije raka rezistentnim na, TGF-beta indukovani, cell cycle arrest i migraciju ali ne i na TGF-indukovanu epitelno-mezenhimnu transformaciju, ukazujući da gubitak Smad4 abolish TGF-beta posredovane tumor-supresivne funkcije dok istovremeno neke TGF-posredovane tumor-promoting funkcije ostavlja nepromenjenim. SMAD4/DPC4 inaktivacija se događa u kasnijem stadijumu razvoja karcinoma pankreasa i udružena je sa kraćim preživljavanjem pacijenata.