Udruženje žena obolelih i lečenih od raka dojke „Budimo Zajedno“ iz Beograda želi da vas upozna da je korisnicima mobilnih telefona i tablet računara u Srbiji od skoro dostupna mobilna aplikacija Breast Test – “Veruj svojim rukama”.

Ova aplikacija olakšava pravilan I redovan samopregled dojki i rano prepoznavanje promena koje mogu biti znak nastanka karcinoma. Dojke bi trebalo pažljivo pregledati 7 do 10 dana nakon početka menstrualnog ciklusa, ili ukoliko ga niste imali, na odabrani dan u mesecu.

Aplikacija je potpuno besplatna i dostupna na srpskom jeziku kao i na nekoliko stranih jezika (engleski, slovenački, mađarski, poljski, litvanski, hrvatski…) na Google Play za Android (podesite jezik na telefonu na srpski, da bi se sadržaj aplikacije prikazao na srpskom) i App Store marketu za Apple uređaje (po otvaranju aplikacije izaberite srpski jezik). Aplikacija je osmišljena kako bi se samopregled dojki radio redovno i na pravilan način.

     
Uz pomoć mobilnog telefona svaka žena u šest koraka može napraviti pravilan samopregled dojki. Osim toga, u svakom trenutku korisnice aplikacije mogu voditi dnevnik s beleškama, proveriti termin poslednjeg pregleda a aplikacija će ih podsetiti kad je vreme da se napravi novi.

Ovom aplikacijom želimo da ženama u Srbiji približimo samopregled dojki, jer je pravilan i redovan samopregled presudan za rano otkrivanje promena u dojci, koje mogu ukazivati na karcinom.

izvor: Udruženje žena obolelih i lečenih od raka dojke „Budimo zajedno“

The post Mobilna aplikacija: BREAST TEST – veruj svojim rukama appeared first on Svet Medicine.

Istraživači sa Univerziteta u Teksasu (The University of Texas MD Anderson Cancer Center), u studiji objavljenoj u onlajn izdanju The Lancet Oncology, ističu da nam je već poznata činjenica da prisustvo cirkulišućih tumorskih ćelija u krvi korelira sa lošom prognozom kada se rak dojke proširi na druge delove tela (metastatski rak dojke).

Sada, njihova poslednja studija, jedna od prvih i najvećih svoje vrste, pokazuje da CTCs mogu da imaju sličnu prediktivnu vrednost kod ranih stadijuma bolesti.

Većini bolesnika, lečenim za rane stadijume raka dojke, koji se nije proširio (metastazirao), su hirurški odstranjeni limfni nodusi i tumor a potom su podvrgnuti hemio- i radioterapiji, u cilju uklanjanja svih preostalih tragova bolesti.

Ali, nakon dve godine, kada je vremenski dostignut pik recidiviranja, kako navodi autor Anthony Lucci, profesor na odeljenju hirurške onkologije, kod oko jedne trećine ovih bolesnika će se otkriti povratak raka u nekom drugom delu tela; želeli smo da saznamo ZAŠTO.

Profesor navodi da su otkrili da se ćelije raka odvajaju od primarnog tumora veoma rano, kao i da se i u najranijim stadijumima razvoja raka mogu rasejati ove opasne ćelije. Za sada možemo sa sigurnošću detektovati cirkulišuće tumorske ćelije u 25% ne-metastaskog raka dojke bez dokaza o bolesti, i znamo da je rizik recidiviranja i umiranja oko četri puta veći nego kod onih koji u krvi nemaju ove ćelije – ističe Lucci.

Istraživanjem je obuhvaćeno oko 300 bolesnika sa rakom dojke, prosečne starosti oko 54. godine, sa I, II i III stadijumom bolesti, a niti jedan ispitanik nije primao hemioterapiju pre davanja uzoraka krvi. Iz studije su isključeni bolesnici sa rakom u drugoj dojci, ili oni kod kojih se razvio novi karcinom unutar pet godina od postavljanja dijagnoze raka dojke. 

U detekciji i izračunavanju CTCs korišćen je Veridex Cell Search sistem; rezultati su potom korelirani sa karakteristikama tumora, poput veličine i gradusa; hormonskim statusom (estrogen, progesteron, HER2); i obimom zahvaćenosti limfnih nodusa.

Srednje vreme praćenja bolesnika je bilo oko 35 meseci.

Pronašli su da:

• detekcija  jedne ili više CTCs ukazuje na smanjenje perioda bez bolesti ili pojavu ranih recidiva bolesti, kao i na smanjenje ukupne stope preživljavanja.
• kod 15% bolesnika sa makar jednom CTCs javili su se recidivi, u poređenju sa stopom recidiva od 3% kod onih bez detektovanih CTCs
• posle dvogodišnjeg praćenja, period bez progresije bolesti kod bolesnika bez detektovanih CTCs je 98%; u poređenju sa 87% bolesnika sa 1 ili više CTCs, 79% bolesnika sa 2 ili više CTCs, i 69% za one sa 3 ili više CTCs.

Lucci i kolege zaključuju:

”Prisustvo jednog ili više cirkulišućih tumorskih ćelija ukazuje na rano recidiviranje i smanjenu stopu ukupnog preživljavanja kod bolesnika sa nemetastatskim rakom dojke. Ovi rezultati sugerišu da bi procenjivanje cirkulišućih tumorskih ćelija (CTCs) moglo da pruži važne prognostičke informacije kod ovih bolesnika.”

Autori će u nastavku istraživanja pokušati da istraže koje CTCs uspostavljaju metastaze van primarnog mesta, a koje uopšte ne preživljavaju van ove regije.

Dalja istraživanja su neophodna u potvrđivanju ili opovrgavanju ovih ranih rezultata koje su pokazali naučnici sa Univerziteta u Teksasu, SAD.

Reference

• “Circulating tumour cells in non-metastatic breast cancer: a prospective study”; Anthony Lucci, Carolyn S Hall, Ashutosh K Lodhi, Anirban Bhattacharyya, Amber E Anderson, Lianchun Xiao, Isabelle Bedrosian, Henry M Kuerer, and Savitri Krishnamurthy; The Lancet Oncology, Published online first 6 June 2012 ; DOI: 10.1016/S1470-2045(12)70209-7. 
• Catharine Paddock PhD. “Blood Test In Early Stage Breast Cancer May Predict Recurrence And Survival.” Medical News Today. MediLexicon, Intl., 6 Jun. 2012.
• photo > http://www.topnews.net.nz

Dr Marko Bogdanovic

Dr Marko Bogdanović je specijalista opšte hirurgije na Klinici za digestivnu hirurgiju UKCS, sa užim profesionalnim fokusom na HPB hirurgiju i onkologiju. Detaljne informacije o kliničkom radu, stručnim usavršavanjima i naučnim doprinosima možete pogledati na stranici: Kompletna biografija autora.

www.svetmedicine.com

The post Analizom krvi predvideti recidive i preživljavanje kod raka dojke? appeared first on Svet Medicine.

Savremena naučna istraživanja u oblasti farmacije, medicine, biohemije, koncipiraju se tako da se obavljaju na kulturama izolovanih ćelija, sa ciljem da se prouče delovanja brojnih noksi na ćelijskom, subćelijskom, tj. molekularnom nivou, genskom nivou, kao i pokrenuti mehanizami ćelijskih odgovora na delovanje brojnih egzo-/endogenih agenasa, time i ova naučna grana toksikologije dobija sve više na značaju.

Takođe, u prilog ovome, treba naglasiti da se broj noksi, kojima je biosvet izložen na ovaj ili onaj način, iz dana u dan značajno uvećava iz razloga sveukupnog svetskog tehnološkog razvoja. Takođe razvoj tehnologoije doprinosi da naučna istraživanja danas mogu biti na mnogo sofisticiranijem nivou nego što su to bila pola veka unazad.

DNK I GENI

Različite ćelije istog organizma i različite jedinke iste vrste imaju isti broj hromozoma koji u somatskim ćelijama čoveka iznosi 46 odn. 23 para od čega je 1 par onaj koji označava pol (XX ženski i XY muški), dok u je polnim ćelijama ovaj broj duplo manji.

Homologi hromozomi su jednaki u broju i redosledu gena.

Gen je deo DNK odgovoran za sintezu tacno određenog proteina ili RNK molekula i on kontroliše određene nasledne osobine.

Gen je sačinjen od niza genetskih kodova i veličina gena tj. “genskog lokusa“ iznosi ~ 600-1800 nukleotida

Gen predstavlja:

1. Jedinicu strukture hromozoma
2. Jedinicu fiziološke funkcije hromozoma
3. Jedinicu mutacije hromozoma

Geni predstavljaju pojedine delove molekule DNK i time imaju određeno mesto u hromozomu. Građa gena zavisi od 4 pomenuta nukleotida, pri čemu je ovaj redosled jedinstven i karakterističan za svaki gen.

Broj nukleotida u DNK je različit kod različitih bioloških vrsti. Tako npr, u DNK virusa ima nekoliko hiljada nukleotida, a u 46 hromozoma čoveka se nalazi nekoliko milijardi nukleotida. Redosled i broj nukleotida, a time i dužina DNK lanca, je stoga specifičan sa svaku biološku vrstu.

Mitohondrijalna DNK ima znatno manji broj nukleotidnih parova, ima više C-G parova od A-T i nije vezana za histone, može biti pričvršćena za mitohondrijalnu membranu ili slobodna. Humana MtDNK sadrži 37 gena. Proteini koji se sintetišu mitohondrijalnom matriksu ne napuštaju mitohondrije. MtDNK je manje stabilna od DNK u nukleusu i lakše podleže različitim genskim mutacijama

Redosled aminokiselina u svakom polipeptidnom lancu (sintetisanom proteinu) uslovljen je redosledom grupa od po tri nukleotidna para-kodova u genu. Geni se linearno smeštaju duž molekule DNK. Promene u kodovima dovode do izmene u prepisanim kodonima na iRNK i time do izmena odgovarajućeg polipeptida.

Značenje koda je isto u svim biološkim vrstama, tj. genetički kod je univerzalan. Odnosno redosled 4 baze u nukleinskoj kiselini DNK određuje redosled aminokiseline u novosintetisanom proteinu. Broj mogućih kodova, od po tri nukleotida iznosi 64 (43).

Kodoni, dalje u proteinskoj sintezi služe kao šifra za ugrađivanje određene aminokiseline u polipeptidima.

Najveći broj kodona (61 triplet) služi za šifrovanje aminokiselina, jer tri kodona na iRNK tzv. stop kodoni označavaju završetak polipeptidnog lanca.

Fenotip je skup svih morfoloških i funkcionalnih osobina koje karakterišu jednu jedinku.

Genotip je skup svih genetskih informacija koje se nalaze u jednoj ćeliji/organizmu.

Geni se nasleđuju, a kako će se razviti fenotip zavisi od sredine u kojoj se organizam razvija (recimo talenat je fenotip, i Rh krvi, prva osobina se može ali i ne mora razviti, dok se druga nasleđuje, ona je isključivo genska. npr. inteligencija kao fenotip, 60% zavisi od gena, 30% od sredine, a 10% od interakcije izmedju ova dva determinišuća faktora).

Vrste genetičkih oštećenja

• 1. Genske mutacije (promene na DNA lancu)
• supstance koje ih izazivaju su mutageni
• 2. Hromozomske aberacije

         (strukturne promene hromatinskog materijala)

• supstance koje ih izazivaju su klastogeni

• 3. Aneuploidija i poliploidija

         (promene u broju hromozoma)

• supstance koje ih izazivaju su aneugeni

Mutacija je trajno nasledno prenosiva promena u genetskom materijalu.

ISPITIVANJE GENOTOKSIČNOSTI

Ispitivanje genotoksičnosti podrazumeva da li ispitivana supstanca izaziva gensko oštećenje polnih i somatskih ćelija.

Ovim ispitivanjima je moguće otkriti proonkogeni potencijal ispitivane supstance. U ovim ispitivanjima test supstancama izlažu se eksperimentalne životinje ili biljke.

Ispitivanje genotoksičnosti mora biti završeno pre početka II faze kliničkih studija.

Primeri potrebnih pitanja pre ispitivanja toksičnosti :

• Da li je to potpuno nova supstanca ili je već bila u upotrebi u nekom vremenskom periodu?
• Da li će biti dodavana u hranu?
• Da li će se aplicirati jedna doza ili ponavljana?
• Kojom dozom će se testirati?
• Koja će starosna grupa biti tretirana?
• Da li se može očekivati izloženost trudnih žena ili dece?

Glavna biološka razmatranja pre testiranja toksičnosti :

• koja je najpogodnija životinjska vrsta za ispitivanje
• pol životinje
• uslovi i način čuvanja životinja
• način prehrane
• zdravlje životinja
• sličnosti u metabolizmu prema ljudima
• put aplikacije pri tretmanu
• trajanje testiranja
• potreban broj životinja

IN VITRO I IN VIVO METODE

In vitro metode i in vivo metode imaju različite uloge u istraživanju, i one su međusobno komplementarne.

Zavisno od predmeta istraživanja in vitro metode mogu biti najadekvatnije metode u nekim oblastima istraživanja, zbog toga što one mogu dati najtačnije podatke koji su potrebni (na ćelijskom i molekularnom nivou).

In vitro metode pomažu istraživačima da precizno utvrde kako i zašto određeni faktor izaziva nastanak (doprinosi nastanku) ili suprotno: sprečava nastanak određene bolesti.

U eksperimentalnim studijama u in vitro uslovima istraživači mogu da ispitaju lanac događaja koji se odvija pri dejstvu tog faktora sa ćelijama (organima) u strogo kontrolisanim uslovima. Studije in vitro su strogo fokusirane, što znači da istraživači mogu kontrolisati odabrane faktore (varijable).

Kada se jednom u nekoj in vitro studiji utvrdi da je suspektan – određeni biološki mehanizam koji može sprečiti nastanak ili povećati rizik za pojavu određene bolesti, on se može lako ispitati u animalnom eksperimentalnom modelu.

Prednosti in vitro metoda :

• kontrolisani uslovi ispitivanja
• nedostatak sisitemskih efekata
• smanjenje varijabilnosti između eksperimenata
• testiranje je brzo (i nije skupo)
• potrebna je mala količina materijala za testiranje
• ograničen je toksični efekat
• mogu se koristiit humane ćelije i tkiva
• mogu se koristiti transgenične ćelije koje nose humane gene
• smanjuje se ispitivanje na eksperimentalnim životinjama.

Prednosti ćelijskih kultura (ispitivanja in vitro) :

• posao nije naporan
• cena nije visoka
• može se ispitati dejstvo novog leka na mnogobrojne tumorske linije
• mogu se ispitati brojne kombinacije lekova.

Nedostaci in vitro metoda :

• generalizovani toksični efekti ne mogu biti ispitani
• dozno zavistan odgovor u in vitro uslovima ne može biti dobijen (radi procene rizika za humanu populaciju)
• sisitemski efekti ne mogu biti ispitani (procenjeni)
• interakcije između tkiva i organa ne mogu biti testirane
• farmakokinetika ne može biti ispitana
• osteljivost pojedinih organa ne može biti procenjena
• hronični efekti ne mogu biti ispitani
• fenomen koji je uočen u uslovima in vitro može biti različit od odgovora ćelija (u organizovanom tkivu) u kome postoje kompenzatorni i adaptivni mehanizmi
• ako je neki fenomen zapažen u in vitro uslovima, neophodno je da se ispita da li on vodi nastanku određene promene (poremećaju građe ili funkcije, nastanku bolesti ili sprečavanju njenog nastanka) u in vivo uslovima.

Ograničenja ćelijskih kultura (ispitivanja in vitro ) :

• ćelijske linije su transformisane, da bi mogle da rastu u uslovima in vitro
• da bi se ispoljilo dejstvo leka, nekad je neophodna metabolička aktivacija in vivo
• moguće su razlike u izloženosti dejstvu leka (vezivanje za proteine, distribucija leka nije uzeta u obzir…)
• mogu postojati razlike u mikro-okruženju tumorskih ćelija (poremećaji vaskularizacije, hipoksija…).

In vivo metode mogu biti :

• humane studije koje nisu invazivne; problemi oko postojanja ranijih bolesti i razlika među individuama koje čine grupu ispitanika
• animalne studije koje prevazilaze probleme koji postoje u humanim studijama; nisu uvek dobri modeli za ispitivanje procesa kod čoveka zbog razlika koje postoje između vrsta.

Bez obzira na tip studije postoje , postoje etički principi kojih se treba pridržavati (odobrenje etičkog komiteta, dobra naučna i dobra klinička praksa…).

Prednosti in vivo studija :

• testiranje faktora u animalnim modelima omogućava istraživačima mnogo bolju kontrolu nego sa ljudima, s obzirom na to da potpuno mogu kontrolisati faktore kojima su izložene eksperimentalne životinje.

Slabosti in vivo studija :

• iako mnogi biološki procesi mogu biti slični, mnoge stvari koje se dešavaju kod miševa (ili drugih eksperimentalnih životinja) ne dešavaju se na isti način kod čoveka i obrnuto.

GENOTOKSIČNI AGENSI

Genetička toksikologija istražuje delovanje nekog agensa usmerenog na nasledne komponente živih sistema.

Genotoksični agens je onaj koji izaziva letalne i nasledne promene u genetičkom materijalu polnih ili somatskih čelija..

Toksikološke promene mogu biti :

• 1) akutne
• smrtnost
• iritacija
• nekroza
• promena normalnih homeopatskih parametara
• neurološki efekti
• 2) subakutne
• promena reproduktivne sposobnosti
• teratološki efekti
• reverzibilna degradacija tkiva
• metabolički poremečaji
• promene ponašanja

• 3) hronične
• ireverzibilna promena tkiva
• karcinogeneza.

Testovi za detekciju genotoksičnih agenasa se zasnivaju na činjenicama .

1. da je DNA ciljni molekul za sve mutagene, a verovatno i većinu kancerogenih agenasa
2. da je DNA nasledni materijal svih ćelijskih organizama.

Podela genotoksičnih agenasa (od A do E)

• A. Agensi prirodnog porekla
• pirolizidinski alkaloidi
• aflatoksin B1

• B. Agensi u industrijim procesima
• alkilirajući agensi, organski rastvarači, org. jed. metala, ekozagadjivači
• aldehidi, epoksidi (u izradi celuloznih vlakana i pl.masa), ne/organska jed. As, Be, Cr, Co, Cd, Ni i Pb
• C. Farmaceutski proizvodi (lekovi iz grupa):
• antibiotika (streptomicin; doksorubicin i daunorubicin)
• citostatika (mitomicin, bleomicin; metotreksat, ciklofosfamid, citarabin, cisplatin, vinka alkaloidi vinkristin i vinblastin)
• psihofarmaka (hlorpromazin, fenotiazini)
• narkotika
• anestetika (halotan metoksifluran, divinil etar, etilviniletar i trihhloretilen)
• kontraceptiva
• supstance (aromatični amini i dr. aditivi) koje ulaze u sastav nekih kozmetičkih preparata (boje za kosu).

• D. Pesticidi
• Alkilirajući agensi: organska halogena jedinjenja (Cl/Br-metan biotansformacijom daju vinil hlorid)
• Derivati fluorosirćetne kiseline (rodenticidi)
• Piretrini – aletrin (insekticidi)
• Organohlorna jedinjenja (DDT, aldrin, dieldrin, heptahlor, hlordan)
• E. Agensi koji se nalaze u hrani i u vodi
• Prirodni sastojci: mikotoksini i proizvodi metabolizma nekih bakterija (nitrozamin i benzo(a) piren)
• Konzervansi: nitriti i nitrati (etilnitrozourea)
• Veštački zasladjivači: saharin i ciklamati
• Hlorinacijom vode stvaraju se trihlormetan i hlorfenoli

Osnovni genotoksični testovi

Osnovni kriterijumi za odabir testova genotoksičnosti :

• evaluacija rezultata na čoveku
• osteljivost – da se izbegnu lažno pozitivni ili lažno negativni rezultati
• ponovljivost -. uniforman test i stroga standardizacija eksperimanetalnih protokola
• brzina izvođenja testa
• jednostavnost
• ekonomičnost.

Neophodno je napraviti dobar odabir testova (bateriju testiranja prema traženoj regulativi): npr OECD (organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj), EEMS (Evropska organizacija za sredinsku mutagenezu), WHO (Svetska zdravstvena organizacija).

Ove institucije su predložile tri osnovne grupe testova :

1. Testovi za detekciju genskih mutacija
2. Testovi za detekciju hromozomskih aberacija
3. Testovi za otkrivanje efekata na nivou DNK.

Opšta klasifikacija testova mutageneze (prema OECD) :

• 1) Testovi za otkrivanje genskih mutacija
• Test povratnih mutacija na bakteriji Salmomella typhimurium (Amesov test )
• Test povratnih mutacija na bakteriji Escherichia coli
• Test genskih mutacija u kulturi ćelija sisara
• Test polno-vezanih recesivnih letalnih mutacija kod Drosophilia melanogaster
• Test genskih mutacija na kvascu Saccharomyces cerevisiae
• Test specifičnog lokusa kod miša

Ovi testovi su jednostavni, brzi, reproducibilni i daju pouzdane podatke o reakciji hem. agensa sa DNK i indukciji mutacije. + ili – rezultat u sistemima sa bakterijama i gljivicama nije pouzdan pokazatelj da se isti efekti ostvaruju i u ćelijama sisara. Testovi sa kvascem, ćelijama sisara i vinskoj mušici Drosophila melanogaster daju podatke o uticaju mutagena na germinativne ćelije. Testovi sa miševima se koriste za potvrđivanje indukcije somatskih genskih mutacija kod sisara.

• 2) Testovi za detekciju hromozomskih aberacija
• In vitro citogenetički test
• In vivo citogenetički test (na svetlosnom mikrokopu uočavaju se hromozomske aberacije i aberacije hromatida; koriste se limfociti periferne krvi – imaju mali broj i velike hromozome; pouzdaniji su od in vitro)
• Mikronukleus test (na koštanim ćelijama glodara (broje se mikronukleusi – obojeni fragmenti hromozoma), u polihromatskim eritrocitima i analizom hromozoma u metafazi)
• Citogenetički test na polnim ćelijama sisara
• Test naslednih translokacija (ispituju se agensi koji izazivaju mutacije u germinatinim ćelijama)

• 3) Testovi za otkrivanje efekata na nivou DNK
• DNA oštećenje i popravka
• Neprogramirana DNA sinteza
• Mitotička rekombinacija (crossing–over i konverzija gena) kod kvasca Saccharomyces cerevisiae
• Test izmene sestrinskih hromatida in vitro
• Komet test.

Za prenos rezultata ispitivanja toksičnosti na čoveka neophono je odrediti graničnu dozu-najveća doza koja ne uzrokuje štetne efekte (NOAEL– no observable adverse effect level). Ta doza je merilo za normiranje dnevne doze ostatka toksikanta u hrani čoveka.

„Faktor sigurnosti“ – maksimalno netoksična doza u hroničnim ispitivanjima toksičnosti umanji se 100 i više puta (10x zbog ekstrapolacije sa životinje na čoveka-više kvantitativne nego kvalitativne razlike, i 10x zbog razlike među ljudima)

Amesov test (esej hormozomskih aberacija) – princip

Amesovim testom se dokazuje mutageni potencijal ispitivanog jedinjenja.

Mutanti Salmonelle typhimurium preporucenih od strane OECD (Organizacije za ekonomsku saradnju i razvoj) pri EU: TA1535, TA1537, TA98, TA100,TA102.

Test se vrši na mutantima ST. Ovi sojevi imaju imaju tačkaste mutacije na kodu (triplet nukleotida na DNK odgovoran za sintezu jedne aminokiseline), u ovom slučaju, za HISTIDIN (His) i kao tako nefunkcionalni, ne mogu da sintetišu His.

Svi sojevi Salmonelle typhimirium, i normalni (Wild types) i mutanti, mogu da se razvijaju samo u medijumu u kome postoji His.

U prisustvu genotoksične supstance (mutagena) odvija se reverzna tačkasta mutacija (izmena baza ili frame-shifts) na ovom već mutiranom kodu i stvara se funkcionalan kod (moguća sinteza His) i te je moguć je razvoj novoizmenjenog soja Salmonelle typhimurium.

Protokol Amesovog testa :

Otprillike 107 bakterija mutanta ST se inkubira u prisustvu 6 serija razblaženja ispitivane supstance na 37ºC tokom 90 minuta u medijumu koji sadrži His (dovoljno za dve ćelijske deobe).

Dalje se ove kulture ponaosob, razblaže u medijumu odgovarajućeg pH bez His, razliju u 48 udubljenja (wells) ploče sa 384 udubljenja i inkubiraju narednih 48 sati na 37ºC.

Razvijene kolonije (za svaku primenjenu dozu ispitivane supstance, tj. razblaženje) se porede sa kontrolom (mutanti kojima nije dodata ispitivana supstanca – 0 doza). Svaka doza se radi u triplikatu.

Da li su i metaboliti ispitivane supstance genotoksični utvrđuje se dodatkom S9 frakcije jetre (subćelijksa frakcija hepatocita bogata enzimima za metabolizam ksenobiotika) u medijum za uzgajanje bakterijskih kultura.

Prednosti i nedostaci Amesovog testa :

• Rezultati Amesovog testa su neophodni u procesu registracije jedinjenja od strane FDA-IND (Food and Drug Administration- Investigational New Drug).
• Iako, pozitivan rezultat Amesovog testa jeste potvrda genotoksičnosti ispitivanog jedinjenja, negativan rezultat ne znači da to jedinjenje nije genotoksično za ćelije sisara!
• Iz tog razloga se preporučuje primena testa GreenScreen HC (Human Cells) Test, na humanim ćelijama (GADD45a) koje imaju sposobnost da se adaptiraju na genotoksični stres. Ova fluorescentna metoda daje pozitivne rezultate za direktne mutagene, klastogene i aneugene, kao i na inhibitore topoizomeraza i polimeraza (FDA je još uvek ne primenjuje)
• Preporuka je da se prvo uradi GST, a potom Ames Test neposredno pre aplikacije za FDA-IND registaciju.

In Vitro Micronucleus Test

Dokazuju se genotoksični karcinogeni (oni koji ostecuju DNK).

Princip testa :

Mikronukleus (MN) se formira tokom metafaze/anafaze mitoze i može poteći od celog hromozoma (aneugeni događaj – gubitak hromozoma) ili dela prekinutog hromozoma (klastogeni događaj) koji se nisu integrisali u jedro ćerki ćelija.

MN se detektuje fluorescentnom bojenom High Content Screening (HCS) tehnikom.

Kao i za Amesov test, moguće je upotrebiti S9 frakciju jetre za ispitivanje genotoksičnog karcinogenog efekta metabolita.

Kombinacija MN testa s fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) sa sondom omogucava označavanje (peri-) centromernog regiona hromozoma (FISH test) i razlikovanje između MN koji sadrže celi hromozom (centromere pozitivni MN) i acentricni kromozom – fragment (centromere negativni MN).

HCS-baziran in vitro MN test istovremeno prati nekoliko ishoda:

• Preživljavanje ćelija (cell count), integritet membrana (cytotoxicity assessment), i ćelijski deobni ciklus (binucleated cell frequency and proliferation index (CBPI). Ovi parametri odslikavaju stanje ćelija (cytostasis) i moguće stvaranje MN.
• Kvantifikacija MN može biti izvedena relativno lako i kod različitih humanih vrsta ćelija od znacaja za biomonitoring: limfociti, fibroblasti i epitelnih ćelija (samo kada su fizićki odvojene od epitelne površine ili iz bazalnog sloja), bez dodatne in vitro kultivacije.
• Ex vivo / in vitro analizom limfocita u prisustvu cytochalasin–B (dodat 44h od početka inkubacije), inhibitor aktina, moguće je razlikovati jednojedarne ćelije (koje se još nisu podelile) i dvojedarne ćelije, nakon završene deobe tokom in vitro inkubacije.
• U ovim uslovima, učestalost monojedarnih ćelija ukazuje na odnos pozadinskih hromozom/genom mutacija akumuliranih in vivo, dok je učestalost dvojedarnih ćelija sa MN mera ukupnog oštećenja, akumuliranog pre inkubacije plus mutacije koja se razvila tokom prve in vitro mitoze.

ZAKLJUČAK

Toksikologija uključuje praćenje kvalitativnih i kvantitativnih efekata u biološkim sistemima u cilju predviđanja mogućih nastajanja toksičkih efekata. To uključuje ekstrapolaciju između vrsta i između doza ili nivoa izlaganja. Kod hroničnih toksičkih efekata prihvaćen parametar je NAOEL- iz odnosa doza. Takođe se procenjuje ADI (acceptable daily intake), npr. za ksenobiotike ili aditivne hrane.

Procenu za kancerogenost ili teratogenost je teže dati. Teorijski, jedno „izlaganje ili kontakt“ ili reakcija supstance ili njenog metabolita na delu DNA molekula može biti dovoljno za pokretanje kancerozne promene. Bakterijski testovi kao AMES test koriste se za procenu mutagenih promena.

Testovi na životinjskim primarnim ili ćelijskim linijama sisara koriste se za procenu promena u tkivima i organima.

Uzorak tumorskog tkiva može se testirati na osetljivost na terapiju. Primarne tumorske ćelije se razmnože u kulturi in vitro i sagleda se njihov odgovor na predviđenu terapiju paletom testova, što zavisi od dijagnoze i propisane terapije.

Zbog činjenice da maligne ćelije ne reaguju adekvatno na konvencionalnu terapiju, neophodno je prediktivno odrediti koja vrsta terapije će postići željeni efekat.

Analizom ciljanih bioloških markera (ćelijske proliferacije, apoptoze, telomeraze i ekspresije gena) prediktivno se procenjuje osetljivost tumorskih ćelija na terapiju.

Autori

• Dr Marija Petković & Radisav Petković

Reference

• Mirjana Hristić. Biologija sa humanom genetikom. Farmaceutski fakultet.
• Milan Jokanović. Toksikologija.Farmaceutski fakultet. Izdavač Elit Medica, Beograd 2001.
• Casarett and Duull‘s. Toxicology The Basic Science of Poisons. Fifth Edition. Editition McGraw-Hill (USA)1996.

The post In vivo i in vitro testovi genotoksičnosti appeared first on Svet Medicine.