Site icon Svet Medicine

In vivo i in vitro testovi genotoksičnosti

 Genotoksikologija je naučna disciplina koja proučava uticaj hemijskih i fizičkih agenasa na proces prenošenja naslednih osobina. Genotoksikologija je realtivno mlada naučna grana toksikologije.

Savremena naučna istraživanja u oblasti farmacije, medicine, biohemije, koncipiraju se tako da se obavljaju na kulturama izolovanih ćelija, sa ciljem da se prouče delovanja brojnih noksi na ćelijskom, subćelijskom, tj. molekularnom nivou, genskom nivou, kao i pokrenuti mehanizami ćelijskih odgovora na delovanje brojnih egzo-/endogenih agenasa, time i ova naučna grana toksikologije dobija sve više na značaju.

Takođe, u prilog ovome, treba naglasiti da se broj noksi, kojima je biosvet izložen na ovaj ili onaj način, iz dana u dan značajno uvećava iz razloga sveukupnog svetskog tehnološkog razvoja. Takođe razvoj tehnologoije doprinosi da naučna istraživanja danas mogu biti na mnogo sofisticiranijem nivou nego što su to bila pola veka unazad.

DNK I GENI

 

Različite ćelije istog organizma i različite jedinke iste vrste imaju isti broj hromozoma koji u somatskim ćelijama čoveka iznosi 46 odn. 23 para od čega je 1 par onaj koji označava pol (XX ženski i XY muški), dok u je polnim ćelijama ovaj broj duplo manji.

Homologi hromozomi su jednaki u broju i redosledu gena.

Gen je deo DNK odgovoran za sintezu tacno određenog proteina ili RNK molekula i on kontroliše određene nasledne osobine.

Gen je sačinjen od niza genetskih kodova i veličina gena tj. “genskog lokusa“ iznosi ~ 600-1800 nukleotida

Gen predstavlja:

  1. Jedinicu strukture hromozoma
  2. Jedinicu fiziološke funkcije hromozoma
  3. Jedinicu mutacije hromozoma

Geni predstavljaju pojedine delove molekule DNK i time imaju određeno mesto u hromozomu. Građa gena zavisi od 4 pomenuta nukleotida, pri čemu je ovaj redosled jedinstven i karakterističan za svaki gen.

Broj nukleotida u DNK je različit kod različitih bioloških vrsti. Tako npr, u DNK virusa ima nekoliko hiljada nukleotida, a u 46 hromozoma čoveka se nalazi nekoliko milijardi nukleotida. Redosled i broj nukleotida, a time i dužina DNK lanca, je stoga specifičan sa svaku biološku vrstu.

Mitohondrijalna DNK ima znatno manji broj nukleotidnih parova, ima više C-G parova od A-T i nije vezana za histone, može biti pričvršćena za mitohondrijalnu membranu ili slobodna. Humana MtDNK sadrži 37 gena. Proteini koji se sintetišu mitohondrijalnom matriksu ne napuštaju mitohondrije. MtDNK je manje stabilna od DNK u nukleusu i lakše podleže različitim genskim mutacijama

Redosled aminokiselina u svakom polipeptidnom lancu (sintetisanom proteinu) uslovljen je redosledom grupa od po tri nukleotidna para-kodova u genu. Geni se linearno smeštaju duž molekule DNK. Promene u kodovima dovode do izmene u prepisanim kodonima na iRNK i time do izmena odgovarajućeg polipeptida.

Značenje koda je isto u svim biološkim vrstama, tj. genetički kod je univerzalan. Odnosno redosled 4 baze u nukleinskoj kiselini DNK određuje redosled aminokiseline u novosintetisanom proteinu. Broj mogućih kodova, od po tri nukleotida iznosi 64 (43).

Kodoni, dalje u proteinskoj sintezi služe kao šifra za ugrađivanje određene aminokiseline u polipeptidima.

Najveći broj kodona (61 triplet) služi za šifrovanje aminokiselina, jer tri kodona na iRNK tzv. stop kodoni označavaju završetak polipeptidnog lanca.

Fenotip je skup svih morfoloških i funkcionalnih osobina koje karakterišu jednu jedinku.

Genotip je skup svih genetskih informacija koje se nalaze u jednoj ćeliji/organizmu.

Geni se nasleđuju, a kako će se razviti fenotip zavisi od sredine u kojoj se organizam razvija (recimo talenat je fenotip, i Rh krvi, prva osobina se može ali i ne mora razviti, dok se druga nasleđuje, ona je isključivo genska. npr. inteligencija kao fenotip, 60% zavisi od gena, 30% od sredine, a 10% od interakcije izmedju ova dva determinišuća faktora).

Vrste genetičkih oštećenja

         (strukturne promene hromatinskog materijala)

 

         (promene u broju hromozoma)

 

Mutacija je trajno nasledno prenosiva promena u genetskom materijalu.

 

ISPITIVANJE GENOTOKSIČNOSTI

 

Ispitivanje genotoksičnosti podrazumeva da li ispitivana supstanca izaziva gensko oštećenje polnih i somatskih ćelija.

Ovim ispitivanjima je moguće otkriti proonkogeni potencijal ispitivane supstance. U ovim ispitivanjima test supstancama izlažu se eksperimentalne životinje ili biljke.

Ispitivanje genotoksičnosti mora biti završeno pre početka II faze kliničkih studija.

Primeri potrebnih pitanja pre ispitivanja toksičnosti :

 

Glavna biološka razmatranja pre testiranja toksičnosti :

IN VITRO I IN VIVO METODE

 

In vitro metode i in vivo metode imaju različite uloge u istraživanju, i one su međusobno komplementarne.

Zavisno od predmeta istraživanja in vitro metode mogu biti najadekvatnije metode u nekim oblastima istraživanja, zbog toga što one mogu dati najtačnije podatke koji su potrebni (na ćelijskom i molekularnom nivou).

In vitro metode pomažu istraživačima da precizno utvrde kako i zašto određeni faktor izaziva nastanak (doprinosi nastanku) ili suprotno: sprečava nastanak određene bolesti.

U eksperimentalnim studijama u in vitro uslovima istraživači mogu da ispitaju lanac događaja koji se odvija pri dejstvu tog faktora sa ćelijama (organima) u strogo kontrolisanim uslovima. Studije in vitro su strogo fokusirane, što znači da istraživači mogu kontrolisati odabrane faktore (varijable).

Kada se jednom u nekoj in vitro studiji utvrdi da je suspektan – određeni biološki mehanizam koji može sprečiti nastanak ili povećati rizik za pojavu određene bolesti, on se može lako ispitati u animalnom eksperimentalnom modelu.

 

Prednosti in vitro metoda :

 

Prednosti ćelijskih kultura (ispitivanja in vitro) :

 

Nedostaci in vitro metoda :

 

Ograničenja ćelijskih kultura (ispitivanja in vitro ) :

 

In vivo metode mogu biti :

Bez obzira na tip studije postoje , postoje etički principi kojih se treba pridržavati (odobrenje etičkog komiteta, dobra naučna i dobra klinička praksa…).

Prednosti in vivo studija :

Slabosti in vivo studija :

GENOTOKSIČNI AGENSI

 

Genetička toksikologija istražuje delovanje nekog agensa usmerenog na nasledne komponente živih sistema.

Genotoksični agens je onaj koji izaziva letalne i nasledne promene u genetičkom materijalu polnih ili somatskih čelija..

Toksikološke promene mogu biti :

Testovi za detekciju genotoksičnih agenasa se zasnivaju na činjenicama .

  1. da je DNA ciljni molekul za sve mutagene, a verovatno i većinu kancerogenih agenasa
  2. da je DNA nasledni materijal svih ćelijskih organizama.

 

Podela genotoksičnih agenasa (od A do E)

Osnovni genotoksični testovi

 

Osnovni kriterijumi za odabir testova genotoksičnosti :

Neophodno je napraviti dobar odabir testova (bateriju testiranja prema traženoj regulativi): npr OECD (organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj), EEMS (Evropska organizacija za sredinsku mutagenezu), WHO (Svetska zdravstvena organizacija).

Ove institucije su predložile tri osnovne grupe testova :

  1. Testovi za detekciju genskih mutacija
  2. Testovi za detekciju hromozomskih aberacija
  3. Testovi za otkrivanje efekata na nivou DNK.

 

Opšta klasifikacija testova mutageneze (prema OECD) :

Ovi testovi su jednostavni, brzi, reproducibilni i daju pouzdane podatke o reakciji hem. agensa sa DNK i indukciji mutacije. + ili – rezultat u sistemima sa bakterijama i gljivicama nije pouzdan pokazatelj da se isti efekti ostvaruju i u ćelijama sisara. Testovi sa kvascem, ćelijama sisara i vinskoj mušici Drosophila melanogaster daju podatke o uticaju mutagena na germinativne ćelije. Testovi sa miševima se koriste za potvrđivanje indukcije somatskih genskih mutacija kod sisara.

Za prenos rezultata ispitivanja toksičnosti na čoveka neophono je odrediti graničnu dozu-najveća doza koja ne uzrokuje štetne efekte (NOAEL– no observable adverse effect level). Ta doza je merilo za normiranje dnevne doze ostatka toksikanta u hrani čoveka.

„Faktor sigurnosti“ – maksimalno netoksična doza u hroničnim ispitivanjima toksičnosti umanji se 100 i više puta (10x zbog ekstrapolacije sa životinje na čoveka-više kvantitativne nego kvalitativne razlike, i 10x zbog razlike među ljudima)

 

Amesov test (esej hormozomskih aberacija) – princip

 

Amesovim testom se dokazuje mutageni potencijal ispitivanog jedinjenja.

Mutanti Salmonelle typhimurium preporucenih od strane OECD (Organizacije za ekonomsku saradnju i razvoj) pri EU: TA1535, TA1537, TA98, TA100,TA102.

Test se vrši na mutantima ST. Ovi sojevi imaju imaju tačkaste mutacije na kodu (triplet nukleotida na DNK odgovoran za sintezu jedne aminokiseline), u ovom slučaju, za HISTIDIN (His) i kao tako nefunkcionalni, ne mogu da sintetišu His.

Svi sojevi Salmonelle typhimirium, i normalni (Wild types) i mutanti, mogu da se razvijaju samo u medijumu u kome postoji His.

U prisustvu genotoksične supstance (mutagena) odvija se reverzna tačkasta mutacija (izmena baza ili frame-shifts) na ovom već mutiranom kodu i stvara se funkcionalan kod (moguća sinteza His) i te je moguć je razvoj novoizmenjenog soja Salmonelle typhimurium.

Protokol Amesovog testa :

Otprillike 107 bakterija mutanta ST se inkubira u prisustvu 6 serija razblaženja ispitivane supstance na 37ºC tokom 90 minuta u medijumu koji sadrži His (dovoljno za dve ćelijske deobe).

Dalje se ove kulture ponaosob, razblaže u medijumu odgovarajućeg pH bez His, razliju u 48 udubljenja (wells) ploče sa 384 udubljenja i inkubiraju narednih 48 sati na 37ºC.

Razvijene kolonije (za svaku primenjenu dozu ispitivane supstance, tj. razblaženje) se porede sa kontrolom (mutanti kojima nije dodata ispitivana supstanca – 0 doza). Svaka doza se radi u triplikatu.

Da li su i metaboliti ispitivane supstance genotoksični utvrđuje se dodatkom S9 frakcije jetre (subćelijksa frakcija hepatocita bogata enzimima za metabolizam ksenobiotika) u medijum za uzgajanje bakterijskih kultura.

Prednosti i nedostaci Amesovog testa :

 

In Vitro Micronucleus Test

 

Dokazuju se genotoksični karcinogeni (oni koji ostecuju DNK).

Princip testa :

Mikronukleus (MN) se formira tokom metafaze/anafaze mitoze i može poteći od celog hromozoma (aneugeni događaj – gubitak hromozoma) ili dela prekinutog hromozoma (klastogeni događaj) koji se nisu integrisali u jedro ćerki ćelija.

MN se detektuje fluorescentnom bojenom High Content Screening (HCS) tehnikom.

Kao i za Amesov test, moguće je upotrebiti S9 frakciju jetre za ispitivanje genotoksičnog karcinogenog efekta metabolita.

Kombinacija MN testa s fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) sa sondom omogucava označavanje (peri-) centromernog regiona hromozoma (FISH test) i razlikovanje između MN koji sadrže celi hromozom (centromere pozitivni MN) i acentricni kromozom – fragment (centromere negativni MN).

HCS-baziran in vitro MN test istovremeno prati nekoliko ishoda:

 

ZAKLJUČAK

Toksikologija uključuje praćenje kvalitativnih i kvantitativnih efekata u biološkim sistemima u cilju predviđanja mogućih nastajanja toksičkih efekata. To uključuje ekstrapolaciju između vrsta i između doza ili nivoa izlaganja. Kod hroničnih toksičkih efekata prihvaćen parametar je NAOEL- iz odnosa doza. Takođe se procenjuje ADI (acceptable daily intake), npr. za ksenobiotike ili aditivne hrane.

Procenu za kancerogenost ili teratogenost je teže dati. Teorijski, jedno „izlaganje ili kontakt“ ili reakcija supstance ili njenog metabolita na delu DNA molekula može biti dovoljno za pokretanje kancerozne promene. Bakterijski testovi kao AMES test koriste se za procenu mutagenih promena.

Testovi na životinjskim primarnim ili ćelijskim linijama sisara koriste se za procenu promena u tkivima i organima.

Uzorak tumorskog tkiva može se testirati na osetljivost na terapiju. Primarne tumorske ćelije se razmnože u kulturi in vitro i sagleda se njihov odgovor na predviđenu terapiju paletom testova, što zavisi od dijagnoze i propisane terapije.

Zbog činjenice da maligne ćelije ne reaguju adekvatno na konvencionalnu terapiju, neophodno je prediktivno odrediti koja vrsta terapije će postići željeni efekat.

Analizom ciljanih bioloških markera (ćelijske proliferacije, apoptoze, telomeraze i ekspresije gena) prediktivno se procenjuje osetljivost tumorskih ćelija na terapiju.

 

Autori

Reference

Exit mobile version