Vaskulogeneza je proces stvaranja krvnih sudova u embrionu, u kojoj se krvni sudovi formiraju iz endotelnih ćelijskih prekursora koje nazivamo angioblasti. Angiogeneza ili neovaskularizacija je proces stvaranja krvnih sudova u odraslih i donedavno se smatralo da je rezultat grananja i širenja već postojećih krvnih sudova. Međutim, eksperimenti upućuju da postoje dva načina stvaranja novih krvnih sudova:
- angiogeneza pomoću endotelnih prekursorskih ćelija (,,endothelial progenitor cells” – EPCs) iz koštane srži;
- angiogeneza iz već postojećih krvnih sudova
Angiogeneza je važan u nizu fizioloških, ali i patoloških procesa u ljudskom organizmu. Fiziološki se nalazi tokom embrionalnog razvoja, zarastanja rane, za vreme formiranja žutog tela i folikula jajnika te u rastu endometrijuma. Patološka je karakteristična za kardiovaskularne bolesti (ateroskleroza), hronične inflamatorne bolesti (reumatoidni artritis, Crohnova bolest), dijabetes (dijabetička retinopatija), psorijazu, endometriozu. Rast i razvoj te metastaziranje malignih tumora zavise od angiogeneze.
Prva istraživanja angiogeneze započela su 1962. godine u Bethesdi kada su F. Becker i J. Folkman proučavali hemoglobinske rastvore kao moguću zamenu za transfuziju. Kasnije su Folkman i saradnici uvideli da endotelne ćelije bubre, ali ne mogu proliferisati u hemoglobinskim rastvorima koji ne sadrže trombocite. To je bio jedan od najranijih eksperimentalnih modela koji je pokazao da tumorski rast može biti zakočen ako se tumor drži u “prevaskularnom stanju” iz čega autori zaključuju da su tumorski rast i metastaziranje zavisni od angiogeneze. Naime, u nastalom tumoru svakom povećanju broja tumorskih ćelija prethodi povećanje broja novih krvnih kapilara.
Angiogeneza iz endotelnih prekursorskih ćelija
Formiranje hematopoetskog i vaskularnog sistema započinje tokom embrionalnog razvoja čije su preteče dva tipa ćelija:
- hemangioblasti – ćelije koje se pretvaraju u hematopoetske stem ćelije i
- angioblasti – ćelije koje čine osnovu vaskularnog sistema.
Angioblasti proliferišu, migriraju u periferna tkiva i diferenciraju se u endotelne ćelije koje formiraju arterije, vene i limfne sudove. Oni stimulišu i stvaranje pericita, glatkih mišićnih ćelija te zajedno čine periendotelnu ćelijsku barijeru. U novije vreme otkriveno je postojanje ćelija sličnih angioblastima koje zovemo EPCs (“endothelial precursor cells”) u koštanoj srži odraslih ljudi. One u određenom trenutku ulaze u cirkulaciju, te migriraju do oštećenog ili tumorski promenjenog tkiva gde stimulišu stvaranje kapilarne mreže. Priroda ovog mehanizma još je nedovoljno istražena.
Angiogeneza iz već postojećih krvnih sudova
U ovom tipu angiogeneze novi kapilari izrastaju iz malih venula bez mišićnog sloja. U prisustvu angiogenskog stimulusa započinje razgradnja bazalne membrane i endotelne ćelije venula šire se kroz njihov zid.
Najbitniji delovi ovog procesa su:
- vazodilatacija kao odgovor na pisustvo azotnog oksida (NO) i izazvanu pojačanu propustljivost već postojećih krvnih sudova zbog delovanja vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF),
- proteolitička razgradnja bazalne membrane roditeljskih krvnih sudova metaloproteinazama i prekid međućelijskog kontakta između endotelnih ćelija krvnih sudova uzrokovan aktivirajućim faktorom plazminogena,
- migracija endotelnih ćelija prema angiogenom stimulatoru,
- proliferacija endotelnih ćelija, odmah pored vodećeg pupoljka migrirajućih ćelija,
- sazrevanje endotelnih ćelija što uključuje inhibiciju rasta i remodeliranje u kapilaru,
- mobilizacija periendotelnih ćelija (uključujući pericite za male kapilare i glatke mišićne ćelije za velike krvne sudove) da bi podržavale endotelne strukture i formirale pravi krvni sud.
Većina tumora kod čoveka nastaje bez angiogene aktivnosti i mesecima i godinama egzistira in-situ kao lezije mikroskopske veličine, prečnika od 0,2-2mm, nakon čega se mali procent njih može transformisati u angiogeni fenitip. Kod većine kancera kod čoveka angiogeni fenotip se javlja posle histološke potvrde malignog fenotip. Međutim kod izvesnih tumora čoveka (npr.karcinom grlića materice), preneoplastična faza displazije postaje angiogena pre histološke potvrde malignog fenotipa. Kada neangiogeni karcinom in situ nastane u avaskularnom epidermu ili mukozi (npr.melnom ili karcinom dojke), on je odvojen od postojećih krvnih sudova bazalnom membranom. Ukoliko neangiogeni tumor nastane u sredini vaskularizovanog tkiva (npr.karcinom pankreasnih ostrvaca), može formirati in situ mikrocilindar građen od tumorskih ćelija koje okružuju kapilare (nazvane koopcija (cooption)).
Aktivacija endotelnih ćelija odigrava se pod uticajem citokina. U angiogenezu su uključeni brojni činioci od kojih neki stimulišu, a neki inhibišu angiogenezu.
VEGF je prvi i najvažniji stimulator angiogeneze. Izlučuju ga tumorske ćelije, makrofagi i druge ćelije koje učestvuju u procesu imunskog odgovora. Otkrili su ga Dvorak i sar., a molekularnu strukturu definisao je Ferrara. Postoji više grupa VEGF: VEGFA, VEGFB, VEGFC i VEGFD, od kojih je VEGFA najvažniji. To je multifunkcionalan glikoprotein molekularne težine 34 do 45 kD koji ima niz važnijih uloga na endotel krvnih sudova. Uticaj na endotelne ćelije dešava se preko dve vrste receptora koji imaju tirozin-kinaznu aktivnost: flt-1 i KDR. Osim citokina, važni su i ostali mehanizmi uključeni u kontrolu angiogeneze. Primer takvog egzogenog činioca jesu hormoni koji svojim delovanjem mogu stimulisati angiogenezu.
Ćelije imunoskog sistema kao monociti/makrofagi, limfociti i mastociti mogu menjati ravnotežu između stimulatora i inhibitora angiogeneze. T-limfociti su važni za aktivaciju endotelne ekspresije različitih metaloproteinaza preko interakcije CD-40/CD-40-ligandom.
Hipoksija je važan faktor koji stimuliše neovaskularizaciju.
Mnogi onkogeni c-myb, sis i src dokazani su kao stimulatori ekspresije mnogih molekula uključenih u angiogenezu. Mutirani ras-onkogen učestvuje u regulaciji produkcije stimulatora angiogeneze kao što su TGF-α, TGF-β i VEGF.
Osim toga aktivacija onkogena podstiče proizvodnju i aktivaciju enzima koji razlažu bazalnu membranu i ekstracelularni matriks.
Tumor-supresorski geni i njihovi proteini takođe imaju ulogu u stimulaciji angiogeneze. Inaktivacija p53-gena i njegovog proteina smanjuje proizvodnju trombospondina, inhibitora angiogeneze te se na taj način stimuliše angiogeneza.
Klinički se angiogeni switch prepoznaje po povećanju tumorske mase do detektabilne veličine, lokalnim krvarenjem i metastazama. Pre pojave neovaskularizacije tumorske ćelije obično ne ulaze u cirkulaciju, tj. udaljene metastaze se ne mogu detektovati pre promene u angiogeni fenotip.
Na ćelijskom nivou su kod tumora čovek i miša identifikovana bar 4 mehanizma angiogenog switch-a:
- avaskularni karcinomi in situ mogu dopuniti svoje zalihe krvi stimulacijom neovaskularizacije iz susednih vaskularnih korita, što je slučaj sa većinom tumora čoveka
- cirkulišući prekursor endotelnih ćelija iz kostne srži može se ugraditi u angiogeni fokus
- tumori mogu podstaći fibroblasti i/ili makrofage domaćina u ležištu tumora da ispolje prekomernu ekspresiju angiogenog faktora (vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF))
- već postojeći krvni sudovi mogu biti angažovani od strane tumorskih ćelija.
Kada tumor jednom postane angiogeni, retko se vraća u neangiogeni fenotip (izuzeci su retinoblastom i neuroblastom). Nakon angiogenog switch-a novi mikrokapilari se slivaju ka malom in situ tumoru. Tumorske ćelije rastu kao mikrocilindri, stvarajući ,,perivaskularne manžetne” oko svakog novog krvnog suda. Jedna endotelna ćelija može snabdevati od 5-100 tumorskih ćelija.
Na molekularnom nivou angiogeni switch u tumorskim ćelijama deluje putem promene ravnoteže u produkciji molekula koji pozitivno i negativno regulišu angiogenezu. Prekomerna ekspresija pozitivnih regulatora angiogeneze i smanjena ekspresija inhibitora angiogeneze u ranim fazama razvoja tumora su generalno uzrokovane mutacijama gena koji kontrolišu angiogenezu. Prekomerna ekspresija ras onkogena povećava produkciju angiogenog proteina VEGF, dok mutacije ili delecije p-53 tumor-supresornog gena smanjuju produkciju trombospondina 1, proteina koji inhibiše angiogenezu. U normalnim ćelijama divlji tip p53 stimuliše produkciju trombospondina 1 i smanjuje produkciju VEGF.
Angiogeni switch može biti modifikovan i različitim uticajima sredine, kao što su hipoksija, endogeni inhibitori angiogeneze i genetska osnova domaćina.
- 1. HIPOKSIJA. Kada tumor postane neovaskularizovan, njegov dalji rast izaziva povišenje tkivnog pritiska. Ovo povišenje intersticijskog pritiska je uzrokovano sporim proticanjem plazme kroz novoformirane krvne sudove i nemogućnošću plazme da se izlije iz tumora zbog nedostatka limfatika unutar tumora. Centralni krvni sudovi prvi bivaju komprimovani što vodi centralnoj nekrozi. Hipoksija aktivira hipoksija-induktivni faktor HIF-1, koji se vezuje za sekvencu VEGF promotera. Ovo dovodi do transkripcije VEGF iRNK, povećava stabilnost VEGF poruke i podiže produkciju VEGF proteina na nivo viši od genetski uzrokovanog. Tumori ne povećavaju svoje vaskularno korito, nego ga komprimuju. Karcinomi in situ nastali iz avaskularnog korita (npr.epiderm) nisu hipoksični, ali veći tumori sa pojačanom neovaskularizacijom postaju hipokični nakon kompresije sopstvenog vaskularnog korita. Nizak pH i koncentracija glikoze u tumoru takođe mogu uticati na povećanje produkcije endogenih faktora angiogeneze, posebno VEGF.
- 2. ENDOGENI INHIBITORI ANGIOGENEZE. Na molekularnom nivou neoangiogeneza može biti modifikovana i endotelnim inhibitorima koji su ili cirkulišući (npr.interferon (INF) β, trombocitni faktor 4, angiostatin) ili se oslobađaju iz ekstracelularnog matriksa (npr.endostatin, trombospondin-1 i inhibitori tkivnih metaloproteinaza (TIMPs)). Terapijska primena endogenih inhibitora angiogeneze, kao što su angiostatin ilil endostatin, može održavati ravnotežu angiogeneze, smanjivanjem ili poništavanjem angiogenog potencijala tumor.
- 3. GENETSKA KONTROLA ODGOVORA DOMAĆINA. Kao što je angiogeni potencijal nekog tumora određen aonkogenima i tumor-supresornim genima, tako je i angiogeni odgovor domaćina genski regulisan.
Endogeni promotori angiogeneze
Neki od poznatih endogenih promotora angiogeneze su: bazni faktor rasata fibroblasta (FGF-2), kiseli faktor rast fibroblasta (FGF-1), angiogenin, transformišući faktor rasta α, trasnformišući faktor rasta β, faktor tumorske nekroze α, vaskularni endotelni faktor rasta VEGF, trombocitni faktor rasta, interleukin 8, proliferin, angiopeotin-1, leptin.Praktično svi proteini su produkti različitih tipova tumora. Ipak, kiseli FGF (aFGF), bazni FGF (bFGF). VEGF i angiopoetin 1 i 2 najviše su proučeni i nađeni su u širokom spektru tumora kod čoveka.
Faktori rasta fibroblasta. aFGF i bFGF stimulišu deobu i migraciju endotelnih ćelija in vitro, a među najpotentnijim su angiogenim proteinima in vitro, a inaju visok afinitet za heparin i heparin-sulfat. Mnoge ćelije sintetišu bFGF, uključujući ćelije tumora centralnog nervnog sistema, sarkoma, genitourinarnih tumora, pa čak i endotelne ćelije tumorske vaskulature. Neki tumori angažuju makrofage i aktiviraju ih da sekretuju bFGF, dok drugi privlače mast-ćelije koje, zbog visokog sadržaja heparina, sekvestriraju bFGF. bFGF nije specifični mitogeni agens samo za endotelne ćelije već i za još nekoliko vrsta ćelija, uključujući i fibroblaste, glatke mišićne ćelije i neurone. bFGF utiče na adheziju leukocita na endotel; stoga tumori koji stvaraju bFGF mogu doprineti određenoj vrsti lokalne imunološke tolerancije.
Abnormalno povišeni nivoi bFGF nađeni su u serumu i urinu pacijenata sa kancerom, kao i u cerebrospinainoj tečnosti pacijenata sa različitim tipovima tumora mozga. Visok nivo bFGF kod renalnog karcinoma je u korelaciji sa lošom prognozom. Takođe, nivo bFGF u urinu dece sa Wilmsovim tumorom je u korelaciji sa stadijumom bolesti i gradusom tumora.
Vaskulami endoteini faktor rasta/Vaskularni faktor permeabiliteta Prvobitna pretpostavka da je tumorska angiogeneza udružena sa povećanjem mikrovaskulame propustijivosti dovela je do identifikacije vaskulamog faktora propustljivosti (VPF). VPF je zatim sintetisan i pokazano je da je on specifični induktor angiogeneze; nazvan je vaskularni endotelni faktor rasta. Njegov permeabilni efekat na kapilare je moćniji od efekta histamina i odgovoran je za nastanak ascitesa kod karcinoma ovarijuma i edema kod tumora mozga. Njegova ekspresija je u korelaciji sa rastom krvnih sudova u embriogenezi i s angiogenezom u ženskom reproduktivnom traktu i u tumorima. VEGF je 40 do 45-kDa težak homodimemi protein sa signalnom sekvencom, koji sekretuje široki spektar zdravih, kao i većinu tumorskih ćelija. Na primer, preko 60% karcinoma dojke vrši ekspresiju VEGF. VEGF postoji u pet različitih izoformi od 121, 145, 165, 189 i 206 amino-kiselina, od kojih je VEGF165 predominantna molekulska vrsta koju sekretuje mnoštvo normalnih i neoplastičnih ćelija Na vaskularnim endotelnim ćelijama su pronađene uglavnom dve vrste receptora za VEGF, 180-kDa teška fms-slična tirozin-kinaza (Flt-1) i 200-kDa težak receptor sa umetnutim domenom ljudske kinaze sa svojim mišjim homologom, Flk-1. VEGF se vezuje za oba receptora, ali samo KDR/Flk-1 prenosi signale za endotelnu proliferaciju i hemotaksu. Površinski vezani VEGF čini endotelne ćelije hemotaktičnim za tumorske ćelije ili može delovati parakrino, i time omogućiti organizovanje tumorskih ćelija oko mikrokapilara.
Ras onkogen reguliše ekspresiju VEGF. Inhibitori farnesil-transferaze sprečavaju ekspresiju. Jedan od mehanizama njihovog antitumorskog delovanja je inhibicija angiogeneze sprečavanjem VEGF ekspresije.
Von Hippel-Lindauov (VHL) protein inhibiše ekspresiju VEGF. VHL-tumor supresorski gen je inaktivisan kod bolesnika sa VHL bolešću i kod većine sporadičnih renalnih karcinoma jasnih ćelija (clear-cell) što dovodi do VEGF posredovane angiogeneze. VHL gen normalno suprimuje hipoksijom-induktivne gene, uključujući eritropoetin. Kada postoji mutacija ili delecija VHL gena. ovi geni su prekomemo eksprimovanu čak i u uslovima normalnog snabdevanja kiseonikom.
Eksperimentalni dokazi govore da funkcija bFGF delimično zavisi od VEGF. bFGF uzrokuje ekspresiju VEGF. Formiranje kapilarnih sudova in vitro stimulišu dva endotelna mitogena, koji deluju sinergistički. Sistemska primena rastvorljivog receptora za VEGF (Flk-l) kompletno blokira angiogenezu u rožnjači oka, uzrokovanu implantacijom bFGF. Važan zaključak ovih studija je da inhibitori angiogeneze koji blokiraju VEGF mogu takođe inhibisati i bFGF.
Angiopoetini. Tie2 je receptor koji je pronađen samo na endotelnim ćelijama.To je specifična tirozin-kinaza, čiji je ligand angiopoetin-1. Angiopoetin-1 stimuliše endotelne ćelije da angažuju pericite i glatke mišićne ćelije [prvenstveno produkcijom trombocitnog faktora rasta (PDGF -platelet-derived growth factor) BB], koji bivaju inkorporisani u zidove krvnog suda. Krvni sudovi stimulisani angiopoetinom-1 nepropustljivi su i analozi su novih krvnih sudova u procesu zarastanja rana. Angiopoetin-2 biokira Tie-2 receptor i odbija pericite i glatke mišićne ćelije. Proizvode ga ćelije vaskularnog endotela ležišta tumora. Međutim, tumorski krvni sudovi su tanke “cevi obložene endotelom”, iako dijametri nekih od ovih krvnih sudova dostižu veličinu venule. Ključna tačka je da angiopoetin-2 i VEGF zajedno povećavaju angiogenezu. Sve u svemu, ako je VEGF neutralisan ili ga nema, endotelne ćeiije će, bez perivaskularnih glatkih mišićnih ćeiija i pericita, podleći apoptozi i nastaće regresija novoformiranih krvnih sudova. Ove razlike govore da je angiogeneza u tumorima mnogo osetljivija na inhibitore angiogeneze, nego angiogeneza u procesu zarastanja rana. Endostatin inhibiše rast tumora na mišjem modelu bez usporavanja procesa zarastanja rana.
Endogeni inhibitori angiogeneze Poznato je da određeni endogeni inhibitori angiogeneze igraju važnu ulogu u procesu angiogenog “switcha”: IFN-a, trombocitni faktor 4 i klasa angiostatičkih steroida tipiziranih tetrahidrokortizolom.
Trombospondin-1. Pokazano je da je produkcija trombospondina-1 obrnuto proporcionaina sposobnosti ćeiijskih linija da stvaraju tumor i krvne sudove in vivo; gubitak produkcije trombospondina-1 omogućava ne-tumorigenim ćelijama da postanu tumorigene. Trombospondin-l je regulisan divljim tipom gena p53. Gubitak fiinkcije p53 u tumorskim ćelijama značajno smanjuje nivo inhibitora angiogeneze. Obnavljanje funkcije p53 pojačava inhibiciju i smanjuje angiogenu aktivnost tumorskih ćelija. Angiogena promena je kontrolisana negativnim regulatorima agiogeneze koju produkuju tumori. Sama angiogena promena je defmisana kao promena ukupne ravnoteže stimulatora i inhibitora angiogeneze. Ovo je dovelo do otkrića angiostatina, drugog inhibitora koji je umešan u proces angiogenog “switcha.”.
Angiostatin, endostatin, antiangiogeni antitrombin III. Na osnovu nekoliko kliničkih i eksperimentalnih studija pretpostavljeno je da izvesni tumori mogu produkovati inhibitore angiogeneze. Odstranjenje nekih tumora (npr. karcinoma dojke, kolona i osteogenih sarkoma) može biti praćeno rapidnim pojačanjem rasta udaljenih metastaza. Primarni tumor može sprečiti rast metastaza sekundamog tumora, npr. karcinom dojke može da inhibiše metastaze malignog melanoma. Parcijalna spontana regresija primamog tumora kod malignog melanoma može biti praćena rapidnim rastom udaljenih metastaza. Kod odstranjenja dela primamog tumora (npr. citoreduktivna operacija kod karcinoma testisa), rezidualni tumor povećava brzinu rasta. Sličan fenomen je registrovan i kod životinjskih tumora, tj. određeni primarni tumori inhibišu rast ali ne i broj sopstvenih metastaza. Hirurško odstranjenje primamog tumora povećava brzinu rasta rezidualnog tumora. Mnogi primarni tumori mogu suprimirati rast drugog inokulisanog tumora. Ova “rezistencija” na drugi tumor je obrnuto proporcionalna veličini tumorskog inokuluma i direktno proporcionalna veličini primarnog tumora. Postoji kritična veličina primarnog tumora da bi se ispoljio ovaj inhibitomi efekat.
Postavljene su najmanje tri hipoteze koje objašnjavaju ovakva zapažanja i eksperimente: (1) “konkomitantna imunost” – primarni tumor indukuje imunološki odgovor na sekundarni tumor ili metastaze u istom domaćinu: (2) iscrpljivanje nutritivnih sastojaka od strane primarnog tumora; ili (3) produkcija antimitotičkih faktora od strane primarnog tumora, koji direktno inhibišu proliferaciju sekundarnog tumora.
Kada je jednom shvaćeno da tumori mogu stvarati i pozitivne i negativne regulatore angiogeneze, postalo je jasno da primarni tumor u toku stimulacije angiogeneze u sopstvenom vaskularnom koritu verovatno može i inhibisati angiogenezu u vaskulamom koritu udaljenih metastaza. Dva uslova bi mogla biti neophodna: (1) primarni tumor (tj. tumor koji je prvi nastao) trebalo bi da stvara u svom vaskulamom koritu promotore angiogeneze u višku u odnosu na inhibitore i (2) pretpostavljeni inhibitor bi trebalo da ima duže poluvreme života u cirkulaciji nego što bi imao promotor angiogeneze. Istraživanja su identifikovala angiostatin, endostatin i antiangiogeni antitrombin kao negativne regulatore angiogeneze.
Lewisov karcinom pluća stvara angiostatin, koji je 38-kDa težak produkt plazminogena. Sistemski primenjen, prečisceni angiostatin je potpuno inhibisao rast metastaza, stvarajući mirne tumore mikroskopske veličine (prečnika <200 um) u plućima, a takođe je inhibisao i rast primarnog tumora. Angiostatin ne sekretuju tumorske ćelije, već nastaje proteolitičkim razlaganjem cirkulišućeg piazminogena pomoću velikog broja enzima oslobođenih iz tumorskih ćelija. Najmanje jedan od tih tumor-sekretovanih enzima, aktivator urokinaza plazminogena (uPA — urokinase plasminogen activator), konvertuje plazminogen u plazmin, dok fosfoglicerat-kinaza iz hipoksičnih tumorskih ćelija nakon toga redukuje plazmin, koji tada može biti konvertovan u angiostatin pomoću jedne iz grupe metaloproteinaza. Stvaranje angiostatina je registrovano i u drugim tipovima kancera (npr. kod karcinoma prostate). Antigen specifičan za prostatu stvara iz plazminogena fragmente slične angiostatinu.
Dalje, kada se fibrosarkomske ćelije miša transfektuju angiostatinom, nastaju primarni supkutani tumori. Njihov rast je usporen proporcionalno sa povećanjem nivoa angiostatina koji produkuju tumorske ćelije. U ovim tumorima totalni angiogeni output primarnog tumora je smanjen transfekcijom angiostatinom, koji deluje suprotno od promotora angiogeneze sekretovanim od strane tumorskih ćelija, u dozno-zavisnom smislu, ali ga nikada potpuno ne neutraiše. Stepen tumorskog rasta (rast tumorske mase) direktno je srazmeran ukupnom angiogenom outputu tumora, obrnuto srazmeran produkciji angiostatina i apoptozi tumorskih ćelija, i praktično ne zavisi od proliferacije tumorskih ćelija.
Gustina tumorske mikrocirkulacije
Gustina tumorske mikrocirkulacije (MVD, engl. “microvessel density” ili IMD, “intratumor microvessel density”) pokazatelj je intenziteta angiogeneze. Govori o broju krvnih sudova po jedinici površine. Niz studija upućuje na povezanost MVD-a s ekspresijom stimulatora angiogeneze, tumorskim rastom i pojavom udaljenih metastaza. Mnoge su studije pokazale direktnu povezanost između izlučivanja proangiogenih citokina i MVD-a. Ekspresija VEGF-a korelira s MVD-om u mnogim solidnim tumorima [prostata, debelo crevo, jetra, dojka]. Toi i sar. upoređivali su MVD i VEGF i PDGF kod 152 bolesnice s invazivnim duktalnim karcinomom dojke te su dokazali da u 70% slučajeva postoji pojačana ekspresija oba stimulatora angiogeneze. Vrednosti VEGF-a i PDGF-a u krvi bile su značajno povezane s vrednošću MVD-a. Signifikantnu povezanost MVD-a s lučenjem VEGF-a nalazimo u radovima o karcinomu želuca i karcinomu cerviksa . Objavljeni su radovi koji pokazuju povezanost MVD-a i drugih stimulatora angiogeneze kao bFGF-a.
Različita radiološka ispitivanja tumorskog krvotoka koreliraju s MVD-om. Magnetna rezonanca (MR), kolor dopler i pozitronska emisiona tomografija (PET) radiološke su metode kojima se pokazalo da i one mogu dokazati promene u MVD-u.
Budući da je pojava metastaza najvažniji prognostički faktor kod bolesnica s karcinomom, određivanje metastatskog potencijala primarnog tumora od velikog je značaja. Liota i sar. su još pre 20 godina na animalnome modelu dokazali povezanost MVD-a s brojem intravaskularnih tumorskih ćelija i pojavom plućnih metastaza. Stadijum angiogeneze u mnogim tumorima može predvideti pojavu metastaza. Ovo zapažanje najpre je opisano kod melanoma. Dokazana je jasna razlika stadijuma bez neovaskularizacije kada su metastaze retke i stadijuma s intenzivnom neovaskularizacijom koji je povezan s čestim lokalnim i udaljenim metastazama.
Nizom radova dokazano je da je MVD nezavisni prognostički faktor u predviđanju ishoda mnogih karcinoma .
MVD se može odrediti upotrebom imunohistohemijskih marker koji se vežu za različite komponente endotelne ćelije. To su antitela protiv specifičnih antigena. Postoje dve kategorije tih antitela, odnosno markera. Prvu grupu čine panendotelni ćelijski markeri (CD 31, CD 34, faktor VIII) koji se osim na endotelne ćelije vezuju i na fibroblaste, ćelije zapaljenskog odgovora ili stromalne ćelije. Drugu grupu čine antitela koja se vežu samo na aktivirane endotelne ćelije ili endotelne ćelije u proliferaciji.
Endoglin (CD 105) deo je receptorskog kompleksa za TGF-β 1 i 3 molekule koje se stvaraju u tumorskoj angiogenezi. Endoglinska antitela preferiraju aktivirane endotelne ćelije koje učestvuju u tumorskoj angiogenezi. CD 105 ima mnoge prednosti nad panendotelnim markerima. Različite su studije dokazale da je mnogo osetljiviji i specifičniji od svih dosad korišćenih. Dokazano je da se anti CD 105-antitela vežu na sve novostvorene endotelne ćelije i krvne sudove te samo na 20% prethodno formiranih krvnih sudova (neneoplastične). Ne vezuju se na inflamatorne i stromalne ćelije što utiče na smanjenje broja lažno pozitivnih rezultata.
Angiogeneza i lečenje malignih tumora
Angiogeneza ima centralnu ulogu u tumorskom rastu te je atraktivan terapijski cilj (posebno kod bolesnica rezistentnih na hemoterapiju). Budući da je ona rezultat međudelovanja stimulatora i inhibitora, postavljena su dva strateška cilja:
- lečenje inhibicijom stimulatora angiogeneze
- egzogena primena inhibitora.
Poznati su i lekovi koji su u različitim fazama pretkliničkog i kliničkog ispitivanja, a retki su u široj primeni. Prema mehanizmu delovanja to su:
Anti-VEGF neutrališuća antitela
Bevacizumab
To je prvi inhibitor angiogeneze odobren od FDA (Food and Drug Administration, SAD) za lečenje uznapredovalog kolorektalnog karcinoma. Lek je monoklonsko antitelo koje neutrališe VEFG te sprečava njegovo vezivanje za receptore (flk-1 i KDR). Odobren je za lečenje metastatskog kolorektalnog karcinoma, metastatskog karcinoma dojke (HER-2-negativan) te karcinoma pluća. Primenjuje se u obliku monoterapije ili kombinacija s polihemoterapijom. U kliničkoj je fazi ispitivanja za karcinom jajnika – rani stadijum, za karcinom bubrega te karcinom cerviksa. Lek se primenjuje intravenski 10 mg/kg svake dve nedelje, a poluvreme eliminacije je 17-21 dan nakon intravenske primene.
Najčešće nuspojave su hipertenzija i proteinurija, dok su zabeležene i one ozbiljnije poput plućne hemoragije i gastrointestinalne fistule.
Inhibitori tirozin kinaze
To su monoklonska antitela koja se vežu za ATP-vezujuću stranu VEGF-receptora KDR/Flk-1. Prednost im je obećavajuća aktivnost u kombinaciji s mogućnošću oralne primene. Deluje inhibitorno i na tirozin kinazu receptora za PDGF, EGF, FGF.
Sorafenib
Sorafenib je mala molekula inhibitor Raf kinaze i VEGF recepor kinaze. Odobren je od FDA za lečenje metastatskog karcinoma bubrega, a i za uznapredovali karcinom jetre.Dobro se podnosi, neki od neželjenih efekata jesu:dijareja, svrab/deskvamacija, mučnina, gađenje, povraćanje alopecija, može indukovati hipertenziju.
Sunitinib
Godine 2006. FDA ga je odobrila za lečenje bolesnika s GIST-om (gastrointestinalni stromalni tumor), ali i za uznapredovali karcinom bubrega kada je razvijena rezistencija ili netolerancija na druge inhibitore. Prestavlja inhibitor receptora tirozin-kinaze, uključujući VEGF receptore 1,2 i 3;c-KIT; PDGF receptore, Fms-slična tirozin-kinaza 3 (FLT-3), RET. Pokazuje snažnu antitumorsku aktivnost ne sasmo na inhibiciju rasta tumora već i na tumorsku regresiju kod karcinoma kolona, melanoma, karcinoma bubrega, koji su povezani sa inhibicijom fosforilacije VEGFR i PDGFR.
Još je niz VEGF-inhibitora u različitim fazama istraživanja i evaluacije: aksitinib za lečenje bolesnika s karcinomom bubrega, XL999, AZD2171, vandetinib i motesanib.
Ostali inhibitori angiogeneze
To su lekovi koji ne deluju na VEGF i njegove receptore, a neki su i u kliničkim istraživanjima.
Angiostatin
Ovaj sistemski inhibitor angiogeneze je 38kD-fragment plazminogena nastao proteolitičkim delovanjem elastaze, a inhibiše proliferaciju endotelnih ćelija nepoznatim mehanizmom.
Endostatin
Ovaj sistemski inhibitor angiogeneze je proteolitički fragment kolagena XVIII, deo perivaskularnog ekstracelularnog matriksa, inhibiše proliferaciju endotelnih ćelija i angiogenezu nepoznatim mehanizmom. Neki su istraživači pokazali da se i angiostatin i endostatin nakupljaju u primarnom tumoru, što bi moglo imati za posledicu supresiju rasta tumora .
Fumagilin (TNP-470 AG)
Sintetski analog fumagilina je gljivični inhibitor proliferacije endotelnih ćelija i angiogeneze. Nalazi se u kliničkim istraživanjima koja su još u toku kao antiangiogeni faktor.
Talidomid
Ovaj je lek prethodno koršćen kao sedativ i antemetik pa povučen s tržišta zbog izuzetno teratogenog i antiangiogenog dejstva. U kliničkim istraživanjima korišćen je kao antiangiogeni faktor u multiplom mijelomu (u kombinaciji sa deksametazonom), idiopatskoj mijeloidnoj metaplaziji i Kapošijevom sarkomu.
COX-2-inhibitori
Koristi se pretežno u istraživanjima karcinoma pluća (“non-small cell lung cancer”) iako pravi mehanizam dejstva još nije u potpunosti poznat. Prostaglandin E2, produkt COX-2 može pojačati tumorski rast i invaziju stimulacijom VEGF-a, inhibišući imunsku odbranu. Široka dostupnost COX-2 inhibitora, kao i potencijalna uloga u pojačanoj ekspresiji u ovoj vrsti karcinoma pluća čini COX-2 racionalnom terapijskom metom u lečenju ove bolesti.
Eksperimentalno dokazana zavisnost rasta malignih tumora od intenziteta angiogeneze daje nam atraktivnu opciju za lečenje malignih bolesti. Obećavajući rezultati zasad su dobijeni istraživanjem monoklonskih anti-VEGF-antitela ili malih molekula VEGF-inhibitora kod kolorektalnog karcinoma, karcinoma bubrega, karcinoma dojke, karcinoma pluća (“non-small cell lung cancer”) i gastrointestinalnog stromalnog karcinoma uz potvrdu njihove delotvornosti u strogo kontrolisanim randomizovanim kliničkim studijama.
Reference:
1. DeVita VT, Lawrence TS, Rosenberg SA, eds. DeVita, Hellman, and Rosenberg’s Cancer: Principles and Practice of Oncology. 8th ed. Philadelphia, Pa: Lippincott Williams & Wilkins; 2008
2. Abeloff MD, et al. Cancer of the breast. In: Abeloff MD, et al. Abeloff’s Clinical Oncology. 4th ed. Philadelphia, Pa.: Churchill Livingstone Elsevier; 2008
3. Bahramsoltani, M., Plendl, J. 2007. Different ways to antiangiogenesis by angiostatin and suramin, and quantitation of angiostain-induced antiangiogenesis. APMIS 115(1):30-46.
4. Brunton, L.L., Lazo, J.S., Parker, K.L. Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. 11th edition. United States: McGraw Hill Medical Publishing Division, 2006.
5. Cai, W., Chen, X. 2006. Anti-Angiogenic Cancer Therapy Based on Integrin avb3 Antagonism. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry 407-428.
6. Dhanabal, M., Jeffers, M., LaRochelle, W.J. 2005. Anti-Angiogenic Therapy as a cancer Treatment Paradigm. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry 5 (2).
7. Oehler, M.K., Bicknell, R. 2003. The Promise of Anti-angiogenic Cancer Therapy. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 30(3).
8. Tonra, J.R., Hicklin, D.J. 2007. Targeting the Vascular Endothelial Growth Factor Pathway in the Treatment of Human Malignancy. Immunological Investigations 36:3-23.